[发明专利]一种mbr-FPGS高效表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程中基因转录调控技术领域。具体涉及一种FPGS高效表达载体及构建方法和应用。

背景技术

自从1948年Farber等首次报道甲氨蝶呤前体——氨蝶呤可以使急性白血病患儿得到缓解以来，以此为基础的化疗方案应运而生。甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）成为目前应用于白血病、淋巴瘤、头颈部肿瘤、骨肉瘤以及多种自身免疫性疾病最为广泛的一种抗代谢药物。研究表明MTX为叶酸同类物，主要借助于还原性叶酸载体(RFC)进入细胞，进入细胞的MTX在叶酰多聚谷氨酸盐合成酶（FPGS）的作用下形成甲氨喋呤多聚谷氨酸盐（MTXPG），MTXγ-谷氨酸水解酶（GGH）则起水解MTXPG的作用，两者的动态平衡保持MTXPG的相对恒定。MTX及MTXPG共同和二氢叶酸竞争与二氢叶酸还原酶(DHFR)结合，从而使二氢叶酸不能被还原成四氢叶酸。因缺乏四氢叶酸，一碳单位形成减少，DNA、RNA合成受限，快速增生的肿瘤细胞因缺乏复制所需的原料而逐渐死亡。决定MTX疗效的主要因素是细胞内MTX和MTXPG的浓度和停留时间。但是，MTX在抑制肿瘤细胞DNA合成的同时也抑制了正常细胞DNA合成，进而导致多种不良反应。大剂量MTX是治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）常用的方法，尤其是治疗T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)需要更大剂量，这是由于T-ALL细胞中FPGS的表达水平很低，细胞内MTX活性代谢产物MTXPG的量很低，必须高剂量使用MTX来补偿，而严重的毒副反应是制约疗效的关键因素。因此，增强肿瘤细胞内的FPGS表达水平，是提高肿瘤细胞对MTX的敏感性，减少MTX对正常细胞的毒性的关键环节。

发明内容

发明目的：针对现在技术中的不足，本发明的目的是提供一种FPGS高效表达载体，以期实现通过转染该质粒后有效提高Jurkat细胞内FPGS的表达水平，并显著增强了细胞对MTX的敏感性，提高了MTX对细胞的抑制率。本发明的另一目的是提供一种构建FPGS高效表达载体的方法。本发明还有一目的是提供FPGS高效表达载体的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种FPGS高效表达载体，质粒载体为pEGFP-C1，在pEGFP-C1的CMV启动子上游含有279bp长的mbr序列，在pEGFP-C1的HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点之间含有FPGS的蛋白质编码区；其中，FPGS序列为说明书核苷酸和氨基酸序列表中的序列1，mbr序列为说明书核苷酸和氨基酸序列表中的序列2。

一种构建FPGS高效表达载体的方法，包括如下步骤：

（1）用Trizol法从Jurkat细胞中提取总RNA，经特异性逆转录引物将RNA逆转录成特异性cDNA，再经PCR扩增得到目的片段FPGS；

特异性逆转录引物FPGS-reverse序列为5’-GGCCAGGCAGCGCACACAAT-3’； 

PCR引物为FPGS-F ：5’-CCCAAGCTTCTATGTCGCGGGCGCGGAGC-3’，

FPGS-R ：5’-CCGGAATTCCTACTGGGACAGTGCGGGCT-3’；

（2）用HindⅢ和EcoRⅠ两个酶分别切取质粒pEGFP-C1和片段FPGS，在T4连接酶的作用下，将酶切后的FPGS片段克隆至pEGFP-C1，制得FPGS-EGFP-C1质粒；采用酶切结合测序的方法鉴定FPGS-EGFP-C1质粒质量；

（3）以Jurkat细胞基因组DNA为模板，用PCR扩增Bcl2基因mbr序列，用AseⅠ酶分别切取纯化后的mbr序列和FPGS-EGFP-C1质粒，在T4连接酶的作用下，连接切取后的两个片段，构建出含有mbr序列的mbr-FPGS高效表达载体，采用菌落PCR结合测序的方法鉴定pEGFP-C1质粒质量；其中，PCR扩增Bcl2基因mbr序列的引物为：

AseⅠ-mbrF:5’-AGTTATATTAATCTTTAGAGTTGCTTTACGTGGC-3’，

AseⅠ-mbrR:5’-AGTTATATTAATAGGATAGCAGCACAGGATTG-3’。

mbr-FPGS高效表达载体在高效表达FPGS蛋白中的应用。

mbr-FPGS高效表达载体在制备用于增强肿瘤细胞对化疗药物MTX敏感性的药物中的应用。

mbr-FPGS高效表达载体在制备用于治疗人类白血病细胞对于化疗药物不敏感的药物中的应用。