[发明专利]一种检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及甘蔗健康种苗与甘蔗抗性鉴定分子生物学技术领域，更具体地涉及一种检测甘蔗中寄生白条病菌拷贝数的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

甘蔗白条病（Leaf Scald Disease, LSD）是由细菌白条黄单胞菌引起的世界性甘蔗病害之一，广泛分布于美国、加拿大等多个国家和地区，也是国内外重要检疫对象之一。白条病菌为Xanthomonas albilineans Dowson，短小杆状，0.6-1.0×0.3μm，由一单极鞭毛游行，呈革兰氏阴性反应，最适生长温度25-28℃，在培养基上凸起，闪光、透明，略红。该病症可分为两个时期：（1）潜伏期病叶的白条常由叶片引申至叶鞘，直而狭，边界明显，宽约1-3毫米，至一线大小，正覆盖在维管束之上，后来整个叶片变淡青色。（2）严重期病叶开始凋萎，病株初现白色，继之枯萎、死亡，病茎节间短小，常产生侧芽茎。该病对甘蔗产量影响较大，一般新植产量损失10%～15%，宿根蔗产量损失更为严重，且影响宿根蔗年限，是甘蔗品种退化的重要原因之一，甘蔗LSD病原菌寄生于维管束中，至今尚无有效的化学防治方法。目前最有效的控制措施就是培育健康种苗，切断白条病菌依靠种苗传播途径。如何快速准确的鉴定甘蔗是否含有LSD病菌是甘蔗健康种苗生产的关键技术之一。现有检测白条病病菌的方法不能定量病原菌数量、准确性差、且费时、费力，因此，生产上迫切需要建立一种能高效、快速、准确、灵敏的检测白条病菌的方法。

植物在长期的进化过程中经常会受到一些病原细菌的侵袭，一些非寄主或抗性植物在抵御病原菌侵害的过程中，是一种重要的抗病机制:过敏性反应 (hypersensitive reaction ,HR)，发生不亲和反应导致病原菌侵入点周围植物细胞快速死亡而获得抗性；而感病植物则和侵染细菌发生亲和反应，最终病原细菌建立寄生并侵染致病。研究发现，植物病原细菌的一种hrp(hypersensitive reaction and pathogenicity gene) 基因参与和介导HR 的发生，并且能够决定病原菌的致病性。hrp 基因可用于植物病原细菌的检测和鉴定， 将其作为检测靶标是目前分子检测的新方向。传统的定性PCR检测技术一直面临着假阳性污染和不能准确定量两大问题，理论上讲，只要待测样品中有一个靶分子，PCR就能扩增出阳性，随即带来了假阳性偏高的问题，而且电泳所用染色剂EB (溴化乙锭)为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康，且电泳花费较长时间。实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）是在常规PCR基础上把荧光共振能量转移与荧光标记探针结合，巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术融合在一起的一项创造性技术，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、准确定量等特点。不仅有效地提高了检测速度和水平，而且检测的灵敏度也比一般的PCR检测方法高出100倍左右，由于不再需要电泳、染色的步骤，大大简化实验操作步骤，缩短检测时间。

本发明通过克隆白条病菌的致病基因之一hrpB，经过NCBI网上序列比对，设计白条病菌的实时荧光定量PCR检测引物与探针，从而提供了一种用于检测甘蔗中寄生的白条病菌拷贝数的实时荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测白条病病菌不能定量病原菌数量、准确性差、且费时、费力，而提供了一种检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量PCR方法，省去了电泳检测时间，检测时间大大缩短，同时提高了检测结果的准确性。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗中寄生的白条病菌的引物及探针，所述的引物为以下序列的引物对：正向引物5’- CACGATGCTGTACACACTGC-3’和反向引物5’-CTTGCAGGACCTTGCTTTG-3’探针：FAM-5’- ACGTCCACGCCGTGAGTTGC-3’-TAMRA，其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，TAMRA为标记在探针3’端的荧光淬灭基团。

本发明还提供了一种检测甘蔗白条病菌的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

（1）利用CTAB法提取白条病菌DNA；