[发明专利]海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物及设计和扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋鱼类线粒体基因组控制区研究领域，涉及一对PCR扩增引物（Marinefish-Dloop），尤其是涉及一种可高效特异地扩增多数海洋鱼类线粒体基因组控制区的扩增引物及设计方法和扩增方法。

背景技术

动物线粒体基因组DNA呈共价闭合环状，包括一条轻链，一条重链，是细胞核外具有自主复制、转录和翻译能力的遗传因子。与核DNA相比，动物线粒体基因组DNA具有拷贝数高，一级结构进化速度快，严格的母系遗传等特点，因而已成为水产养殖业、渔业遗传学研究和进化生物学研究的有力工具。线粒体基因组由37个编码基因及一段主要的非编码区即控制区组成，不同区域其进化速率不同。控制区是线粒体基因组中进化最快的的区域，它的变异速率约为线粒体DNA上其他区域的5~10倍，非常适于亲缘关系较近的群体间比较研究，是进行鱼类群体遗传结构评估、相似种类及不同群体鉴定和濒危物种遗传多样性调查等研究方面的重要遗传标记。此外，线粒体控制区还存在不同程度的功能基序缺失或串联重复等结构变异现象，为研究控制区的进化机制和线粒体DNA复制转录调控机制提供极好的研究材料。

目前利用控制区序列进行鱼类遗传学和进化生物学研究大多是针对每一种鱼类设一对相应的引物，不能适应鱼类种质资源大规模调查分析，并且绝大多数鱼类的线粒体基因组序列信息暂时为空白，缺乏相应的模板序列用于设计扩增引物，因而利用序列保守性设计通用扩增引物用以扩增控制区序列是一种十分高效便利的方法。国内外关于线粒体控制区通用引物的报道主要：Kawaguchi等设计的鱼类线粒体控制区通用引物、丁少雄等设计的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物以及黄志坚等设计的淡水鱼类线粒体控制区扩增引物。然而设计模板序列的选取、设计方法的不同以及通用引物自身扩增能力的局限性，利用已报道的通用引物均不能有效地扩增以石首鱼类为主的多数海洋鱼类，因此设计新的控制区通用引物，同已报道的引物进行互补，对于有效获得绝大多数鱼类线粒体控制区序列是十分必要的。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺点和不足，本发明旨在提供一对可高效特异扩增多数海洋鱼类线粒体基因组控制区的单链寡核苷酸引物，从而为快速有效获取海洋鱼类乃至低等脊椎动物线粒体控制区序列以进行种类鉴定、种质资源调查及控制区进化研究提供了一个有力工具。本发明的目的还在于提供所述海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物的设计方法，以及利用所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物对海洋鱼类线粒体基因组控制区进行扩增的方法。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物，由两条单链寡核苷酸组成，其中轻链引物为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明轻链引物Marinefish-Dloop-Thr-F（SEQ ID No.1）有20个碱基：AGCACCGGTCTTGTAAACCG，位于tRNA-Thr基因上；重链引物Marine-Dloop-Phe-R（SEQ ID No.2）有21个碱基：GGGCTCATCTTAACATCTTCA，位于tRNA-Phe基因上。

本发明所述的海洋鱼类线粒体控制区扩增引物对在东海海域采集的41种海洋鱼类，1种淡水鱼类，均能获得片段在750bp-1200bp之间的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含全部线粒体控制区的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，从而为快速有效获取海洋鱼类线粒体控制区序列以进行种类鉴定、种质资源调查及控制区进化研究提供了一个有力工具。

作为优选，根据本发明所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物，其中所述的海洋鱼类包括眼斑拟石首鱼、鳓鱼、髯毛鰕虎鱼、矛尾复虾虎鱼、大弹涂鱼、斑尾刺虾虎鱼、黄鳍刺鰕虎鱼、青弹涂鱼、矛尾刺鰕虎鱼、双带缟虾虎鱼、短尾大眼鲷、澳洲鲭、鲻鱼、鳄鲬、小黄鱼、大泷六线鱼、若鲹、厦门白姑鱼、尖头黄鳍牙?、带鱼、白姑鱼、刺鲳、鳜鱼、日本方头鱼、角木叶鲽、斑鰶、褐菖鮋、凤鲚、鮸鱼、棘头梅童鱼、黑鳃梅童鱼、红狼牙虾虎鱼、真鲷、横带髭鲷、斜带髭鲷、条石鲷、二长棘鲷、黄姑鱼、黄鳍棘鲷、金色小沙丁鱼、黑鲷。

作为优选，根据本发明所述的海洋鱼类线粒体基因组控制区扩增引物，其中所述的淡水鱼类包括鲫鱼。