[发明专利]一种化学修饰的生麦芽糖淀粉酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种生麦芽糖淀粉酶的化学修饰，尤其是一种利用HNO2修饰生麦芽糖淀粉酶的化学修饰方法，属于酶工程领域。 

背景技术

麦芽糖(Maltose)是由两分子D-葡萄糖通过小1，4-糖苷键连接的还原性二糖，有α和β两种异构体。麦芽糖是淀粉糖的一种，营养价值高，甜味适口，甜度只有蔗糖的1/3，不参加胰岛素代谢，不易吸潮，耐高温，保湿性好，抗结晶，清凉透明。由于麦芽糖具有以上优良性能，在食品、医药等行业中得到广泛应用。目前国内市场上的麦芽糖产品，以饴糖、高麦芽糖浆为主，也有超高麦芽糖浆产品，但高纯度麦芽糖或结晶麦芽糖产品很少。 

因为在国内依然采用传统方法制备麦芽糖，这种生产方法主要是由液化、糖化、脱色、离子交换、浓缩等独立的单元操作组合而成。采用传统方法得到的麦芽糖浆的浓度最高不超过85％。要获得98％以上的高纯度麦芽糖需要经过多重精制，工艺复杂，生产成本很高。而使用生麦芽糖酶生产麦芽糖浆作为一种成节能降耗的生产技术，已成为新趋势。 

生麦芽糖α-淀粉酶(Maltogenicα-amylase，MAase)，全称1，4-α-D-葡聚糖α-麦芽糖基水解酶[1，4-α-D-glucan α-maltohydrolase，EC 3.2.1.133]，俗称麦芽糖淀粉酶，是一类α-1，4-D-葡萄糖苷键的内切淀粉酶，产物为α-麦芽糖。麦芽糖淀粉酶性质非常独特，不同于典型的淀粉酶，它不但可快速水解利用直链淀粉或环状糊精，也能少量利用支链淀粉，具有多底物特性；而且还具有转糖基作用。另外，麦芽糖淀粉酶还能水解阿卡波糖(Acarbose，一种α-淀粉酶的有效抑制剂)，但这与菌种相关。 

麦芽糖淀粉酶作为一种新型的酶制剂，主要用于淀粉及食品烘焙工业。在淀粉行业，麦芽糖淀粉酶可单独或与一种支链淀粉脱支酶一起使用以生产高麦芽糖浆。在食品行业中，由于其独特的抗老化作用，可用于延长焙烤食品的货架期。目前，随着人们对麦芽糖质量要求的进一步提高，对麦芽糖淀粉酶的研究已成为 热点。国外对麦芽糖淀粉酶进行了大量的研究，几家大型酶制剂公司如诺维信、丹尼斯克等，已有麦芽糖淀粉酶面世，但价格昂贵。国内对麦芽糖淀粉酶的研究还处于初级阶段，因此国内目前使用的麦芽糖淀粉酶基本依赖进口。而且，研制的麦芽糖淀粉酶存在最适pH偏高的明显弊端，严重影响其在淀粉工业低pH环境中的应用。酶的化学修饰可以人为的改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围，并且化学修饰具有简单经济的优点，但是在修饰过程中可能会破坏酶分子的结构，降低酶的活性。所以就非常有必要研究酶化学修饰的条件，包括化学修饰剂、反应温度和反应时间等，使酶的活性不损失或损失很少。 

发明说明 

本发明的目的是提供一种化学修饰的生麦芽糖淀粉酶以降低天然麦芽糖淀粉酶的最适pH，使麦芽糖淀粉酶可以在工业低pH的条件下应用。 

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：根据Genebank基因登陆号(NC007333)化学全合成或以此基因设计引物，并通过聚合链式反应(PCR)进行扩增，然后克隆到质粒pet20b(+)，将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)表达，然后用化学试剂进行修饰，并且确定反应体系中修饰剂的最佳浓度。 

具体修饰过程如下： 

将150μL生麦芽糖淀粉酶液加入到170ul的0.1M pH＝6的磷酸缓冲液中，然后加入新鲜制备的0.2M HNO₂至终浓度为10-100mM，将混合好的溶液放在37℃的恒温水浴锅中，反应30min左右。 

其中，所述生麦芽糖淀粉酶的酶液浓度最佳为0.8mg/ml～1.2mg/ml，HNO₂的最佳浓度为45mM。 

通过本方法制备的生麦芽糖淀粉酶的酶，其最适pH从7.0降至5.5，pH稳定范围更宽，最适温度和热稳定性变化不大，更适合工业应用，本发明所述的化学修饰剂价格便宜，用量少，更经济节约。 

附图说明

图1被修饰的酶与未被修饰酶的最适温度曲线。 

□：修饰酶的最适温度曲线；▲：天然酶的最适温度曲线 

图2被修饰的酶与未被修饰酶的最适pH曲线。 

□：修饰酶的最适pH曲线；▲：天然酶的最适pH曲线 

具体实施方式

实施例1修饰的生麦芽糖淀粉酶的制备 

1、生麦芽糖淀粉酶的制备