[发明专利]一种慢病毒感染细胞的检测方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种生物检测方法，具体提供了一种慢病毒感染细胞的检测方法。

背景技术

    核酸配基（Aptamer）就是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA），由于其能与相应的靶分子高特异性和高亲合力地结合，故也称为核酸类抗体。核酸配基是从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中利用一种体外筛选和放大技术分离得到的、能特异性地与靶分子高效结合的寡核苷酸序列。用来获取配基的这种体外筛选过程称为指数富集配体的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)。

目前研究者们已从核酸文库中筛选出多种与蛋白质、核酸、寡肽、氨基酸、有机物、金属离子等特异结合的配基，这些成果多在从事基础研究的实验室取得的，其中包括中国国内的几个Aptamer研究小组，如中科院长春应用化学所，湖南大学生物计量学实验室，华东师范大学、陕西师范大学的电化学实验室以及华中科技大学和军事医学院的一些小组。不过，核酸配基也在被应用于临床诊断，如果在其结合后靶分子活性被抑制的话则也具备潜在的治疗价值，如美国FDA批准OSI Pharmaceuticals公司采用Macugen治疗老年性黄斑变性（Age-related macular degeneration, AMD), 而Archemix公司则正尝试采用其专利核酸配基产品ARC1779治疗包括急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome, ACS)在内的多种急、慢性疾患，等等。而也有研究者利用牛痘病毒感染的人肺源性肿瘤细胞系A549来筛选核酸配基，得到了数种能被特异性识别的、牛痘病毒感染了的细胞系；这些核酸配基的靶分子可能是表达在细胞表面的病毒蛋白分子。

属于VI型逆转录病毒的慢病毒亚群中的某些成员（如HIV）在感染宿主细胞后，能整合到不分裂的宿主细胞的基因组中而导致疾病发生。但目前对慢病毒感染细胞的检测比较麻烦。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种慢病毒感染细胞的检测方法，它能快速、简便、有效地检测被慢病毒感染了的人体组织细胞。

为解决上述技术问题，本发明慢病毒感染细胞的检测方法为：

1）人工合成单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度为20～40碱基，文库容量在10E＾14～10E＾15之间；

2）以MOI=5感染HEK293细胞，室温摇动孵育1小时以助细胞均匀地吸收病毒，在37℃、5%CO₂培养箱孵育12小时后吸弃细胞上培养基开始特异性配基筛选；

3）将随机寡核苷酸文库与位于慢病毒感染了的HEK293细胞表面的靶分子一起孵育, 于4 ℃以120 rpm摇动培养1小时以助配基—配体充分结合； 孵育结束后以PBS洗涤单细胞层；

酶解收获细胞，重悬细胞于0.5mlH₂O、95℃x5min以释放被结合的寡核苷酸配基候选分子；释放出的寡核苷酸配基候选分子，经PCR或者RT-PCR生成新的次一级文库，再与该靶分子结合进行第二轮的筛选，如此反复若干循环，即可筛选出能与该靶子特异性结合的核酸配基；

4）将核酸配基用Cy5标记，并与慢病毒感染了的HEK293细胞一起孵育，洗涤后作流式细胞分析，以评估所筛选、富集核酸配基的活性；非标记的核酸配基竞争实验以提高核酸配基的亲和性及特异性；经鉴定的核酸配基随后克隆至载体上测序分析。

本发明采用合成随机寡核苷酸配基文库、慢病毒感染HEK293细胞、筛选与慢病毒感染细胞特异性结合的配基，即采用慢病毒感染人源性细胞系后筛选特异性核酸配基，发现了新的慢病毒感染检测方法，并探索利用这些核酸配基治疗慢病毒感染的可能性。

与蛋白类抗体相比，核酸类抗体（配基）具有如下的优越性：在体外而非体内（动物、细胞）条件下筛选，特性可依要求改变；筛选条件不同而结果（目的物）不同，动力学参数可依体外诊断条件的要求而改变；克服毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受的限制；在体外化学合成，可以保证时间、质量和数量；特异性和亲和力不受组织或样品中非靶蛋白的干扰；可以在合成时精确、定点，随意连接其它功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等；比抗体的分子小，方便体内影像诊断和治疗；如接上硫代磷酸，可用于细胞内诊断和治疗；变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输。