[发明专利]一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法。

背景技术

大豆是高蛋白和高脂肪含量的作物，营养价值和经济价值都很高。大豆在农作物中是粮食兼油料作物，又是家畜和轻工业的重要原料作物，在国内外市场占有重要的地位。然而，普通栽培大豆由于遗传基础相对狭窄，育种周期相对较长，仅靠常规育种手段难以满足国内外市场对大豆日益增长的需求。随着基因工程的发展，通过转基因技术有目的地将外源基因转入大豆，进而获得综合性状优良的转基因大豆品种，不但可以丰富栽培大豆的基因资源，拓宽栽培大豆相对狭窄的遗传背景，而且还可使大豆在产量、品质等性状上得到明显改善。

大豆是全球公认的难转化作物之一。1988年Hinchee等首次用农杆菌介导法以子叶为外植体，经不定芽获得大豆转基因植株，但是转化效率极其低下。后来发展了以大豆胚尖、下胚轴为外植体，但仍然传转效率不高，且操作繁琐、工作量大、周期长、成本高。因此，寻求高高转化效率的大豆外植体作为外源基因的转化受体显得尤其重要。本发明在前人研究的基础上经过多次的尝试创新了传统的大豆外植体，获得了具有高转化效率的大豆复合型外植体，为转基因大豆的发展提供了很好的转化平台。

中国发明专利申请201010554668.2（公开日2011年2月16日）公开了一种农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，其中外植体制备方法是将大豆种子经乙醇和升汞消毒后浸泡在无菌水中，培养萌发得无菌苗，然后取子叶还未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分下胚轴，保留3~5mm的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽，即得含子叶节的外植体。

中国发明专利申请03816844.8（公开日2005年9月14日）公开了一种转化大豆的方法，其中制备外植体的方法是将用氯气释放处理消毒两次，每次8~18小时，培养种子过夜，然后去除种皮，去除部分下胚轴，保留大约0.5cm的下胚轴，去除一个子叶及其邻近的腋芽，保留附于剩下子叶上的初生叶，再将保留的初生叶除去一部分，保留初生叶基部，得到外植体。

上述第1种方法由于子叶节是经过器官发生再生植株，因此转化体容易形成嵌合体，后代筛选难度大，获得转化植物效率低下；上述第2种方法中由于去掉了大部分下胚轴营养供给受到影响，因此外植体的再生效果差及转化率较低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中用于作为转基因大豆植株的外植体转化效率低、操作繁琐等问题，提供一种新的制备大豆复合型外植体的方法。

本发明的另一目的是利用上述大豆复合型外植体制备快速转基因大豆植株的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备大豆复合型外植体的方法，是将成熟大豆种子消毒（优选在含有氯气的密闭容器内熏蒸消毒4~6h），无菌条件下在萌发培养基中光照培养催芽，催芽24h后，从种子眼处去掉种皮，去掉胚尖两侧的第一片真叶，去掉一片子叶，保留包括胚根的完整下胚轴、胚尖及另一片子叶，即为所述大豆复合型外植体；

具体操作过程可以如下：

将无创伤饱满的成熟大豆种子消毒后在无菌条件下置于萌发培养基中光照培养催芽，培养温度优选25~28℃，催芽24h后从种子眼处去掉种皮，用锋利的解剖刀轻轻拨掉1片子叶，留下一片子叶，接着小心去掉胚尖两侧的第一片真叶，留下刚刚萌动的胚尖，保留完整的下胚轴（包括胚根），所得到的具有完整的下胚轴、胚尖及一片子叶，即为所述大豆复合型外植体，简称CEP外植体（见图1）。本发明制备的复合型外植体能够克服现有外植体操作繁琐、转化体筛选困难、再生率和转化率低的缺点，具有操作简便、再生率及转化率高、转化体筛选简便的特点。

所述萌发培养基成分为30g/L蔗糖和质量百分浓度为0.8 %的琼脂，pH 5.8。

上述制备大豆复合型外植体的方法中大豆种子可以选用任何品种，如华春3号、华春6号或马祖1号等。

一种制备快速转基因大豆植株的方法，步骤如下：

（1）制备大豆CEP外植体：按上述方法制备大豆外植体，将该外植体胚尖朝上垂直播种预培养基中，预培养24~28h；

（2）携带目的基因的农杆菌转化外植体：将携带外源目的基因的农杆菌在YEB液体培养基中扩大培养，扩大培养后的培养液离心，收集沉淀，用共培养基稀释成OD₆₀₀=1.5的菌液，将步骤（1）中预培养后的大豆复合型外植体转移到菌液中，28℃黑暗环境侵染19~23h；