[发明专利]微生物发酵合成阿卡波糖的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种微生物发酵合成阿卡波糖的方法，特别涉及一种在发酵过程中通过添加腺苷蛋氨酸来提高阿卡波糖合成产量的方法。

(二)背景技术

阿卡波糖(Acarbose)是一种有效的α-糖苷酶抑制剂，它通过竞争性地抑制小肠壁上参与碳水化合物降解的α-葡萄糖苷酶的活性，延迟碳水化合物的分解消化，延缓和减少葡萄糖的吸收，从而达到控制人体内餐后的血糖水平，是临床上用于治疗II型糖尿病的口服药物。

阿卡波糖分子式为C₂₅H₄₃NO₁₈，分子量645.6，pKa1值为5.1。上世纪70年代初Frommer等人于从放线菌Actinoplanes utahensis的培养液中首先分离得到阿卡波糖，后经德国拜耳(Bayer)制药公司研制开发，1990年阿卡波糖首先在德国上市，1996年获得FDA批准在美国上市。

根据文献和专利报道，目前国内外阿卡波糖的生产都是利用微生物发酵法制备而得到，其中游动放线菌应用的最为广泛。为获得高时空得率的产物，降低生产成本，以往大多数的研究多集中在高产菌株的诱变选育(包括采用物理、化学等常规方法进行诱变，也包括利用分子生物学技术改造菌种)、发酵培养基(包括碳源、氮源、金属离子等)的优化、发酵条件(包括温度、pH、溶氧、渗透压、搅拌等条件)的优化以及对阿卡波糖生物合成途径中相关基因簇的研究等方面。

对于发酵培养基的优化策略，目前主要是通过选择合适的碳氮源，并控制发酵液中葡萄糖和麦芽糖的适当比例以及设计合理的补料策略来提高阿卡波糖的发酵单位。Lee等研究发现，添加麦芽糖比添加葡萄糖更有利于阿卡波糖的生产，示踪研究结果表明，阿卡波糖的麦芽糖基团是直接从麦芽糖、麦芽三糖或较高分子的麦芽寡糖中得到；高敬红等用Actinoplanes sp AC-17发酵生产阿卡波糖时研究发现，当葡萄糖和麦芽糖的质量比为2∶1时最有利于被菌体摄取用于阿卡波糖的生物合成。而对于发酵条件的优化策略，研究者发现，除了常规发酵参数，如温度、pH、溶氧等条件会对发酵产量造成一定的影响，同时在微生物发酵中通常不考虑的一个参数-渗透压，对阿卡波糖发酵的最终收率也具有明显的影响作用，因而渗透压参数在发酵过程中也常被控制在一个合理的范围内。Beunink等研究发现，Actinoplanes sp.SE50/110生产阿卡波糖时，培养液的渗透压值在300～500mOsm/kg之间有助于阿卡波糖的生产，其最适宜的渗透压值为400mOsm/kg；Choi和Shin的研究表明，Actinoplanes sp.ATCC31044突变株CKD485-16最适宜的渗透压值为500mOsm/kg，发酵水平达到3200mg/L，提高了39％。

阿卡波糖结构类似物是阿卡波糖发酵液中的常见杂质，阿卡波糖的结构(如式I所示)及其同系物的结构如表1所示。欧洲药典对杂质组分的含量有严格的限制，特别是杂质组分C，其与阿卡波糖分子的结构差异仅在于末端糖苷键的不同，致使产品提取分离难度大，成本高。欧洲最新药典要求杂质组分C的含量小于1.5％。因此，在生产过程中如何有效控制并降低杂质C的含量是工业化生产阿卡波糖的一个重要环节。

在现有的阿卡波糖生产工艺中，使用凝胶、大孔树脂等可以去除杂质C或使其含量下降。但是，使用以上工艺在实际工业化生产中存在着上样量小，收率低、成本高、质量低等诸多缺陷。

表1 阿卡波糖及其同系物结构

注：Ac＝Acarviose，Glc＝葡萄糖，Fru＝果糖，Man＝甘露糖

阿卡波糖是游动放线菌的次级代谢产物，而对于通过在培养液中外源添加小分子促进剂来提高阿卡波糖的发酵产量目前尚未有报道。腺苷蛋氨酸(SAM)(如式II所示)，是蛋氨酸的活性形式，它是一种存在于所有活体生物中的一种重要代谢中间体，是仅次于ATP的第二大广泛使用的酶的底物，能够参与生物体内多种生理过程，如转甲基、转硫、转氨丙基等。SAM及其反应生成的中间物可进一步转化，生成一些与信号传导相关的分子(如AHL、AI-2)，这些信号分子能够激活微生物代谢关键途径相关基因的转录从而调节次级代谢产物的生产，所以SAM对于体内的代谢起着非常重要的调控作用。然而，关于SAM对微生物发酵阿卡波糖过程以及产量和质量的影响，目前还尚未有文献报道。

(三)发明内容