[发明专利]双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于环介导等温扩增方法及试纸条，特别是涉及一种双标记核酸扩增方法及其快速检测试纸条。

背景技术

随着现代分子生物学和分子技术的发展，研究开发了许多核酸扩增技术。其中核酸环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），由于其具有特异性强、灵敏度高、反应速度快等特点，在核酸特异性扩增和检测领域具有取代PCR的趋势，成为生命科学领域研究的热点之一。核酸环介导扩增的主要原理是基于对靶序列的6个区域设计2对特异引物，利用一种链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase），在65℃左右的恒温条件下保温约60分钟，完成核酸扩增反应，在存在环引物的情况下，扩增时间可进一步缩短为40分钟。用于LAMP扩增的3对引物对应于靶基因的8个区段，因而具有比PCR 更高的特异性，同时具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。

目前LAMP产物的检测经常采用电泳法和浊度法，需要用高致癌性的荧光染料溴化乙锭，不仅危害操作人员的健康，而且无法排除假阳性的问题，限制了LAMP技术的推广使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题：克服现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、速度快的双标记核酸恒温扩增方法；

还提供了一种用双标记核酸恒温扩增产物得到的简易检测试纸条，该试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测。

本发明的技术方案：

一种双标记核酸恒温扩增方法，根据检测目标设计LAMP 引物，进行内引物、外引物和环引物的合成；用生物素和荧光素分别标记两种内引物，或分别标记两种环引物，或分别标记一种内引物和一种环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增，得到双标记核酸恒温扩增产物。 

所述标记是标记内引物各引物的5’端；所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。

所述恒温扩增是在59-65℃温度下、恒温扩增5-20min。

 一种含有双标记核酸恒温扩增产物的检测试纸条，含有支撑层、吸附层，支撑层为不吸水薄片条，吸附层粘贴于支撑层上，所述吸附层从测试端依次为测试端纤维层、纤维素膜层和手柄端吸水材料层，所述纤维素膜层含有权利要求1所述的双标记核酸恒温扩增产物，用生物素亲和蛋白及荧光素抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，或用生物素亲和蛋白及荧光素金标抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，检测印迹和对照印迹平行排列为“                                                ”。

所述不吸水薄片条为硬质塑料片条或不吸水硬纸片条，所述纤维素膜层是用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，所述手柄端吸水材料层是用吸水纸制成，所述测试端纤维层是用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。

所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。

所述测试端吸附纤维层、吸水材料层上均覆盖有保护膜，在测试端纤维层的保护膜上印制有样品标记线，该标记线距离测试端0.5cm。

所述的检测试纸条在检测各种致病性微生物或病原体的特异性基因中的应用。

本发明的积极有益效果：

１. 本发明的双标记核酸恒温扩增方法具有下列优点：

（1）特异性强，用于LAMP扩增的3对或2对引物分别对应于靶基因的8个或6个区段，理论上可以检测出一个碱基差异的序列，因而具有比PCR 更高的特异性；

（2）灵敏度高，LAMP能在模板DNA纯度很低的情况下进行扩增，很少受培养介质和生物学物质的影响，纯化步骤可以忽略；

（3）速度快，LAMP是恒温扩增反应，没有 PCR反应中温度变化的耗时，在30～60min内即可完成反应过程，10 min内即可完成扩增反应，结合本发明中试纸条检测手段，试纸检测可在5min内完成，加上前处理过程，可在1小时左右完成对样品的检测；

（4）易推广，LAMP反应是一个恒温扩增过程，不用控制温度变化，只需简单的恒温器，也不需要昂贵的 PCR仪，对操作人员的分子生物学技术要求不高。

２.本发明的检测试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测，具体包括：