[发明专利]一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及奇异变形杆菌的检测，具体的说是一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列及其应用。 

背景技术

奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)属于变形杆菌属(Proteus)，广泛存在于泥土、水和粪便等受到污染的环境。奇异变形杆菌是环境中的一种条件致病菌，是一种常见的能够感染人类并引起人体病变的病原菌。近年来，临床上由奇异变形杆菌引起的食物中毒发生率显著提高，严重威胁到人们的健康。但是，有关奇异变形杆菌的检测方法还比较落后，国内外专门开展该菌检测方法研究的报道也较少。 

目前对奇异变形杆菌的检测多采用传统方法，主要以实验室分离和生理生化鉴定为主，此类方法繁琐费时，一般需要4到5天，检测周期比较长，且主观性强，容易造成漏检和误检，因此出现假阳性和假阴性的现象。16SrDNA鉴定亦需要3到5天的时间，而且大多数情况下需要结合生理生化鉴定才能确定细菌为哪一个种群。利用基于特异的核酸标识序列进行PCR检测细菌的技术目前已经得到认同，并且正在推广，该技术相对传统的细菌检测方法具有高通量、检测速度快、特异性强和灵敏度高等优点。利用PCR等分子方法进行奇异变形杆菌的检测具有检测过程快速和灵敏度高等优点。PCR的扩增过程仅需要2个小时，大大缩减了检验检疫所需要的时间，提高了工作效率。而且利用实时荧光定量PCR能够较快和较为准确地对环境中的细菌，尤其是病原菌，进行定量检测。但是目前能够用于PCR检测奇异变形杆菌的特异核酸标识序列发现的还比较少，目前已知的奇异变形杆菌的核酸标识序列主要有16S序列，16S-23S间区序列，ureC序列和一段功能未知的核酸片段。 

发明内容

本发明的目的是提供一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列及其应用。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列： 

ureRF1：5’-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3’ 

ureRR1：5’-ATAATCTGGAAGATGACGAG-3’。 

检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用：所述奇异变形杆菌特异的核酸标识序列应用于检测环境中的奇异变形杆菌。 

采用普通PCR定性检测奇异变形杆菌，具体过程为： 

(1)以核酸标识序列ureRF1和ureRR1为正向引物和反向引物进行PCR，15μl的PCR的反应体系，PCR体系的反应条件为94℃变性4min，然后94℃变性40sec，58℃退火1min，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃继续延伸10min； 

(2)所得PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测PCR产物的有无和大小。 

所述PCR的反应体系为：15μl的PCR反应体系分别加入以下体积的物质，1.5μl的10×PCR缓冲液，0.5μl的10μmol l^-1正向引物，0.5μl的10μmol l^-1反向引物，1.5μl的dNTP混合物，1μl的模板，0.25μl的Taq DNA聚合酶，9.75μl的灭菌双蒸水。 

所述10×PCR缓冲液为200mmol l^-1Tris HCl(pH 8.4)，200mmol l^-1KCl，15mmol l^-1MgCl₂。 

所述步骤(2)琼脂糖凝胶电泳中出现225bp的DNA片段即为，检测样品中含有奇异变形杆菌。 

检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用：采用实时荧光定量(real-time，RT)PCR定量检测奇异变形杆菌，具体过程为： 

(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释，将稀释液10,000rpm离心5min收集菌体，提取细菌的基因组DNA，作为实时荧光定量PCR模板； 

(2)分别以核酸标识序列ureRF1和ureRR1为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR，20μl的实时荧光定量PCR反应体系，实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃变性30sec，然后94℃变性5sec，58℃变性和延伸20sec，循环40个循环，最后94℃热变性15sec，58℃变性和延伸1min，94℃热变性15sec；