[发明专利]神经坏死病毒的RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法，尤其是涉及一种神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)的RT-PCR检测方法。

背景技术

神经性脑病和视网膜病是一种由神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)引起的病毒性神经坏死，该病的特点是引起鱼类脑部和视网膜坏死和空泡化、游泳异常和身体变黑([1]Mori K，Nakai T，Muroga K，Arimoto M，Mushiake K，Furusawa I：Properties of a new virus belonging to nodaviridae found in larval striped jack(Pseudocaranx dentex)with nervous necrosis.Virology 1992，187(1)：368-371；[2]Lin C-C，Lin JH-Y，Chen M-S，Yang H-L：An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper(Epinephelus coioides).Aquaculture 2007，268(0044-8486)：265-273)。NNV在全世界范围内造成了大量海洋硬骨鱼幼鱼和未成年鱼的死亡，并且被感染的硬骨鱼种类也在逐年增加([3]Munday BL，Kwang J，Moody N：Betanodavirus infections of teleostsh：a review.Journal of Fish Diseases 2002，25：127±142)。根据其核苷酸序列、基因组结构、蛋白性质和血清学种类，发现病毒性神经坏死的病因——NNV，一种野田科病毒(Nodaviridae)([4]Morit K，Mangyoku T，Iwamoto T，Arimoto M，Tanaka S，Nakai T：Serological relationships among genotypic variants of betanodavirus.Dis Aquat Organ 2003，57(1-2)：19-26)。NNV是一种直径约为25-30nm的无包膜二十面体颗粒，遗传物质包含两条正意RNA单链，RNA1和RNA2。RNA1编码一种RNA依赖的RNA聚合酶，而较小的RNA2编码外膜蛋白([5]Lai YS，John JA，Guo IC，Chen SC，Fang K，Chang CY：In vitro efficiency of intra-and extracellular immunization with mouse anti-YGNNVantibody against yellow grouper nervous necrosis virus.Vaccine 2002，20(25-26)：3221-3229；[6]Shieh JR，Chi SC：Production of monoclonal antibodies against grouper nervous necrosis virus(GNNV)and development of an antigen capture ELISA.Dis Aquat Organ 2005，63(1)：53-60.)。Nishizawa等人发现SJNNV外膜蛋白基因长1410bp，包含一个1023bp的ORF，编码340个氨基酸，约42kDa的蛋白([7]Nishizawa T，Mori K，Furuhashi M，Nakai T，Furusawa I，Muroga K：Comparison of the coat protein genes of five fish nodaviruses，the causative agents of viral nervous necrosis in marine fish.JGen Virol 1995，76(Pt 7)：1563-1569.)。根据外膜蛋白部分基因序列进行系统分析，神经坏死病毒可分为四大种类：黄带褐鲹神经坏死病毒(striped jack nervous necrosis virus，SJNNV)、红鳍东方鲀神经坏死病毒(tiger puffer nervous necrosis virus，TPNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(barfin flouder nervous necrosis virus，BFNNV)和赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)([8]Dalla Valle L，Toffolo V，Lamprecht M，Maltese C，Bovo G，Belvedere P，Colombo L：Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR.Vet Microbiol 2005，110(3-4)：167-179)。