[发明专利]一种基因拷贝数变异的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因拷贝数变异检测领域，尤其涉及一种利用相似序列结合高分辨熔解曲线分析进行基因拷贝数变异检测的方法。

背景技术

拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)最初是70年前在果蝇Bar基因研究中发现的，后来被认为是动植物基因组中普遍存在的现象，它是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象。有些拷贝数变异属于多态性范畴，并不对动植物的表型造成影响，而有些拷贝数变异则通过扰乱基因序列和改变基因含量来影响基因表达，从而造成表型差异和表型适应，也会引起疾病。保守估计至少10％的人类基因组序列存在拷贝数变异的现象。当功能基因区域如SMN基因、HER2基因等发生拷贝数变异时，可能导致基因产物数量的异常，从而导致非正常表型的出现，引起相关的疾病如脊髓性肌萎缩(SMA)、乳腺癌等。染色体非整倍体(Aneuploidy)也是一种典型的拷贝数变异现象，体细胞内缺失或增加的染色体往往导致危害程度不同的病征，如特纳综合征(45，X)、克氏综合征(47，XXY)、唐氏综合征(47，+21)等。这类遗传病不仅患病率极高，并且后天几乎无法根治。因此，针对此类遗传疾病，人群筛查与产前诊断显得尤为重要。

目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：

1.比较基因组杂交(CGH)：该技术发展至今，已与芯片技术(Microarray)结合后衍生为芯片比较基因组杂交技术(Array-CGH)。该技术可以在全部染色体或染色体亚带水平上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测，从而发现拷贝数变异。然而该技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广。

2.MLPA：全称为多重连接探针扩增技术，是2002年发展起来的一种拷贝数检测方法。目前已有相应的试剂盒检测如SMA、唐氏综合征等疾病。该技术具有较准确的相对定量功能。但是该方法探针制备较为复杂，同时操作步骤繁琐，耗时长。并且采用毛细管电泳作为分析手段，通量较低、成本较高且属于开放式操作，易于造成PCR产物的污染。

高分辨熔解曲线分析(High Resolution Melting，HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的技术，其通过精确的变温速率控制以及DNA饱和染料的指示，实现了通过研究PCR产物序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。由于该技术具有快速、廉价、高通量等优点，已被广泛应用于单核苷酸多态性(SNPs)、基因突变(Mutation)和表观遗传学(Epigenetic)等研究。目前，已有将HRM应用于基因拷贝数变异研究的报道，但均是通过检测待测序列内部的SNP位点来实现的。其原理是待测基因在某个SNP位点上是杂合子，当发生拷贝数变异时，该SNP位点的杂合比例发生了变化，从而在HRM分析中体现出差别。采用该原理具有以下一些不足之处：首先，该方法实现的前提是SNP位点必须是杂合的，否则HRM无法区别两个等位基因序列。这就使得单个SNP位点仅能用于一部分待测群体，而要囊括所有待测群体则必须采用多个SNP位点联合检测，这不仅增加了实验的成本和设计的难度，而且降低了检测的通量。并且，单个核苷酸的差异对于熔解曲线的影响较小，甚至于有些差异几乎不影响熔解曲线的偏移。这是造成检测灵敏度较低的主要因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因拷贝数变异的检测方法。该方法是利用相似序列结合HRM分析进行基因拷贝数变异的检测。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1)根据待测基因序列在全基因组范围内筛选相似但不相同的内源性相似序列(内标法)或者根据待测基因序列人工合成相应的外源性相似序列(外标法)。

2)将待测基因序列与相似序列进行比对，设计共同的扩增引物。如有需要，还可设计相应的非标记探针。

3)采用共同的引物进行PCR，在一个反应管内同时扩增待测基因序列与相似序列。

4)HRM分析PCR产物。

所述相似序列与待测基因序列可以是同源关系，也可以是非同源关系。

所述相似序列可与待测基因序列位于同一染色体上，也可位于不同染色体上。

所述相似序列包括经表观遗传学研究方法如重亚硫酸盐转化(bisulfite conversion)后形成的相似序列。

所述共同的扩增引物可以是一对扩增引物，也可以是多对扩增引物多位点验证。

所述共同的扩增引物与模板可以是完全匹配，也可以是不完全匹配。