[发明专利]基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，具体地说，涉及一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法。

背景技术

标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是开展转基因生物安全监管的基准物。开发转基因成分检测标准物质对原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为0。因而，转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围，主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。

目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体的特征建立特异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。国内外目前还没有针对转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)外源基因纯合/杂合状态检测方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1(KMD1)的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种检测转基因抗虫水稻KMD1的特异性引物，其包括：正向引物5′-TATCTCCTCATTGGCACACCA CCTG-3′和反向引物5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′。该引物对是基于KMD1外源基因的旁侧序列而设计的引物，利用该对引物进行长距离聚合酶链式扩增(long distance PCR，LD-PCR)，以纯合KMD1基因组DNA为模板可以扩增出一条长片段(8884bp)，以杂合KMD1基因组DNA为模板扩增出两条片段(8884bp和240bp)，以非转基因水稻基因组DNA为模板只能扩增出一条短片段(240bp)。

本发明提供基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型KMD1的方法，包括步骤：1)提取植物基因组；2)以步骤1)的基因组为模板，利用上述特异性引物进行PCR检测。

PCR反应条件优选为：94℃ 1min；98℃ 10s，66℃ 10min，30个循环；72℃ 10min。

PCR反应体系优选为：

本发明进一步提供含有上述特异性引物的检测试剂盒及其在检测纯合型转基因抗虫水稻KMD1中的应用。

本发明首次基于外源基因旁侧序列建立转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)的外源基因纯合的鉴定方法，可用于转基因检测用标准物质候选物的筛选鉴定。此外，在转基因作物遗传育种过程中，需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，有利于缩短育种进程。

附图说明

图1为本发明通过LD-PCR在水稻中的扩增结果；其中，M：1kbplus DNA ladder；1：空白对照；2：非转基因水稻明恢63；3：外源基因纯合的KMD1；4：外源基因杂合的KMD1。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。所用试剂和材料均为市售商品，转基因抗虫水稻KMD1和非转基因水稻明恢63可市售获得。

实施例

利用引物，其中正向引物为LA-KMD1F：5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′，反向引物为LA-KMD1R：5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′进行LD-PCR扩增鉴定KMD1的外源基因纯合状态。