[发明专利]基因表达的定量

说明书

本申请为分案申请，原申请的申请日为2003年9月5日，申请号为03824852.2(PCT/US2003/028081)，发明名称为“基因表达的定量”。 

发明背景 

在许多病理学的状况，例如不同的良性和恶性肿瘤、神经系统紊乱、心脏病和自身免疫紊乱中检测和定量差异表达的基因可对这些病理学状况的诊断、预后和治疗有用。基因表达的定量也可用于诊断感染性的疾病和在分子水平上追踪药物或毒素的作用。例如，基因表达数据可用于确定药物或毒素的药理学机制(Libutti et al.，Microarray technology and gene expression analysis for the study of angiogenesis.Expert Opin Biol Ther.2002 Jun；2(5)：545-56)。 

用于转录本检测和定量的方法传统上包括基于Northern-印迹杂交、核糖核酸酶保护分析、和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法。然而，除缺少灵敏性(除RT-PCR外)的缺点外，这些方法只可用于粗略地评估来自不同来源的样本间每种转录本的相对表达的变化。基于RT-PCR的不同方法是为了诊断目的的最合适的定量方法，因为它们是很灵敏的并且因此只需要合乎诊断测试所需的小的样本规模。 

如果想要比较样品之间，甚至相同样品内的基因表达，需要绝对定量样品中转录本的拷贝数。然而，由于PCR反应固有的非线性特性，利用基于PCR的方法很难定量核酸的拷贝数。PCR扩增可从指数阶段变化到试剂耗尽或酶钝化的平台期阶段。经常地，必须分别确定PCR的指数阶段，其可能包括在不同时间点对PCR反应进行取样或利用不同稀释度的模板进行PCR。进一步地，由于模板间扩增效率的差异，不能在线性范围中直接比较不同PCR产物的起始数量。传统上在扩增完成后进行PCR产物的检测。一般地，通过琼脂糖凝胶电泳、用溴化乙啶染色、并且用紫外光显现来区别PCR反应产物等分的大小。备选地，可以用荧光染料或放射性的分子标记引物。比较样品间的条带强度容许定性地估计扩增的模板的相对起始浓度，但是这个方法不是定量的并且不能确定绝对的拷贝数。 

已经描述了许多基于定量的RT-PCR的方法，包括利用PCR和互补 的DNA(cDNA)陈列的RNA定量法(Shalon et al.，Genome Research6(7)：639-45，1996；Bernard et al.，Nucleic Acids Research24(8)：1435-42，1996)、基于引物延伸反应的固相迷你测序方法(美国专利号6,013,431，Suomalainen et al.Mol.Biotechnol.Jun；15(2)：123-31，2000)、离子对高效液相色谱(Doris et al.J.Chromatogr.A May 8；806(1)：47-60，1998)、和5′核酸酶分析或实时RT-PCR(Holland et al.Proc Natl Acad Sci USA88：72767280，1991)。 

研制提供灵敏和精确的定量mRNA转录本的方法将是有用的，其可以是容易地自动化操作的，并且规模扩大至容许测试大量样品，以及克服与PCR扩增相关的问题。这种方法能够诊断不同的病理学状况，包括病毒、细菌和寄生虫，以及不同的良性和恶性肿瘤、神经系统紊乱、心脏病和自身免疫紊乱。这种方法也提供以诊断、预后和治疗为目的的定量令人感兴趣的转录本，并且最终便于基因组药理学的应用。这种方法也可提供对基因表达有影响的大量试剂的筛选。 

发明概述 

本发明涉及测定样品中靶核酸的数量的方法，其中使用的标准物被设计成与目标基因或″靶核酸序列″相比具有一个碱基的差异。使用这种标准物与″增加″标准物与测试的核酸样品中的差异的方法的结合可，利用例如，正好在突变位点进行的碱基延伸反应，容许以相同的效率扩增标准和靶核酸，从而有助于定量靶核酸。此后使用定量″增加的″标准和靶核酸样品的手段来确定靶核酸的数量。在优选的实施方案中，定量手段是质谱法。 

本发明的方法是灵敏的、精确的和高度可重复的，并且它也不依赖于PCR循环的数目，而极大地使分析简单化。本发明的方法是独特的，因为可同时测量相同基因的不同等位基因，可获得对基因表达的绝对定量，因此可直接比较来自不同实验的数据，并且可用于高-通量分析而几乎不需要为了PCR进行优化。另外，该方法容许精确地测定生物标本，例如人的液体(血清、血浆等)中的传染物，例如病毒、细菌和寄生虫的拷贝数。