[发明专利]从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于受溢油污染海水的生物降解处理技术领域，特别涉及一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法。

背景技术

近年来，随着世界各国对石油及其制品日渐增长的需求，在海上开采、装卸、运输以及利用石油过程中溢油事故时有发生，不但造成大量的原油流失，还对环境造成严重污染，日趋严重地威胁着海洋及陆域的生态环境，对海洋环境、自然资源和养殖资源等都有长期的危害，因此，海洋溢油污染已经成为人们必须面对的重大环境问题。在海洋溢油处理技术中，生物修复技术具有高效、经济、安全、无二次污染等特点，已成为现场去除海洋溢油污染的重要选择途径，特别是对机械装置无法清除的薄油层，同时又限制使用化学药剂时，运用生物修复可显出其更大的优越性。若在海洋溢油处理修复工程中使用内源微生物进行降解，由于内源微生物生长速度慢及活性低而修复的效率不高，因此，需要接种一些降解石油烃污染物的高效菌，即通过向海洋溢油环境中加入大量的可存活的并能表现降解活性的石油烃降解菌，以提高海洋中石油污染物的降解速率和程度。

然而由于缺少高效的可应用于海洋溢油处理的石油烃降解菌，制约了海洋溢油生物修复技术的进一步发展和应用。因此，需要从海洋环境中分离与纯化出降解速率较快的纯菌株，然后再把它们应用于实际海洋溢油污染环境的生物治理，这对于治理和修复海洋溢油污染有重要的意义。

但是常规分离与纯化降解菌株的技术无法适用于对海水中存在的石油烃降解纯菌株的分离与纯化。而且分离与纯化的环境条件及过程参数选定等都对分离与纯化出降解菌的降解效能有密切的关系，这些都需要经过一系列的试验研究后才能确定出最佳范围。

发明内容

本发明的目的提供一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法。其具体步骤如下：

(1)选取海水样品4000mL，放置于4℃冰箱中保存备用；

(2)向体积为2500mL的玻璃瓶中加入10g原油，加入40mL正己烷溶解后均匀平铺于玻璃瓶瓶底，为除去正己烷将玻璃瓶开口放置3天；

(3)向步骤(2)中的玻璃瓶中入500mL基础培养基、10mL微量金属液和2mL维生素c溶液；其中基础培养基的组成为：NH₄NO₃：2.0g·L^-1，NaCl：10.5g/L，KH₂PO₄：2.5g·L^-1，FeCl₃：0.10g·L^-1，MgSO₄：3.5g·L^-1，CaCl₂·2H₂O：0.15g·L^-1；微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂O：45mg·L^-1，CuCl₂：0.25mg·L^-1，H₃BO₃：6.5mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O：35mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O：3.5mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O：2.5mg·L^-1，ZnCl₂：3.5mg·L^-1；

(4)向步骤(3)中的玻璃瓶内接入步骤(1)中海水样品1000mL，然后置于温度为10～15℃转速为100r/min的振荡器中培养10～12个月，为维持玻璃瓶内液体总量不变，每隔一周补充步骤(1)中海水样品；

(5)向体积为250mL的锥形瓶中加入1.0g原油，加入4.0mL正己烷溶解后均匀平铺于锥形瓶瓶底，为除去正己烷将锥形瓶开口放置2天；

(6)向步骤(5)中锥形瓶中加入50mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL维生素c溶液；

(7)向步骤(6)中锥形瓶中接入经步骤(4)处理后玻璃瓶内的溶液5mL，然后置于温度为10～15℃转速为100r/min的振荡器中培养6～8天；

(8)按接种体积比为50∶1的比例将步骤(7)中锥形瓶内的溶液转入另一按步骤(5)至(6)处理后的锥形瓶内，然后置于温度为10～15℃转速为100r/min的振荡器中培养6～8天，