[发明专利]从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法

权利要求书

1.一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

(1)选取海水样品4000mL，放置于4℃冰箱中保存备用；

(2)向体积为2500mL的玻璃瓶中加入10g原油，加入40mL正己烷溶解后均匀平铺于玻璃瓶瓶底，为除去正己烷将玻璃瓶开口放置3天；

(3)向步骤(2)中的玻璃瓶中入500mL基础培养基、10mL微量金属液和2mL维生素c溶液；其中基础培养基的组成为：NH₄NO₃·2.0g·L^-1，NaCl：10.5g/L，KH₂PO₄：2.5g·L^-1，FeCl₃：0.10g·L^-1，MgSO₄：3.5g·L^-1，CaCl₂·2H₂O：0.15g·L^-1；微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂O：45mg·L^-1，CuCl₂：0.25mg·L^-1，H₃BO₃：6.5mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O：35mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O：3.5mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O：2.5mg·L^-1，ZnCl₂：3.5mg·L^-1；

(4)向步骤(3)中的玻璃瓶内接入步骤(1)中海水样品1000mL，然后置于温度为10～15℃转速为100r/min的振荡器中培养10～12个月，为维持玻璃瓶内液体总量不变，每隔一周补充步骤(1)中海水样品；

(5)向体积为250mL的锥形瓶中加入1.0g原油，加入4.0mL正己烷溶解后均匀平铺于锥形瓶瓶底，为除去正己烷将锥形瓶开口放置2天；

(6)向步骤(5)中锥形瓶中加入50mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL维生素c溶液；

(7)向步骤(6)中锥形瓶中接入经步骤(4)处理后玻璃瓶内的溶液5mL，然后置于温度为10～15℃转速为100r/min的振荡器中培养6～8天；

(8)按接种体积比为50∶1的比例将步骤(7)中锥形瓶内的溶液转入另一按步骤(5)至(6)处理后的锥形瓶内，然后置于温度为10～15℃转速为100r/min的振荡器中培养6～8天，

(9)按接种体积比为50∶1的比例将步骤(8)中锥形瓶内的溶液转入另一按步骤(5)至(6)处理后的锥形瓶内，然后置于温度为10～15℃转速为100r/min的振荡器中培养6～8天；

(10)重复步骤(8)和(9)三次，每次在进行步骤(8)时，以步骤(9)中锥形瓶内的溶液代替步骤(7)中锥形瓶内的溶液；

(11)向体积为1000mL的玻璃瓶内加入800mL基础培养基、20.0mL微量金属液、4.0mL维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；

(12)向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤(11)配制的液体培养基和0.60g琼脂，然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65～70℃时，在超净工作台中将其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在超净工作台中放置2天；

(13)在超净工作台中向步骤(12)中的培养皿中加入1.5mL原油浓度为15g/L的正己烷溶液，来回倾斜转动培养皿使溶有原油的正己烷溶液均匀分布，为除去培养基表面的正己烷将该培养皿在超净工作台中放置2天；

(14)向体积为25mL的锥形瓶内加入10mL按步骤(11)配制的液体培养基和0.25g琼脂，在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38～40℃；

(15)在超净工作台中向步骤(14)的锥形瓶中加入1mL步骤(10)中锥形瓶内的溶液，摇匀后吸取1mL慢慢加入步骤(13)中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使培养基溶液均匀分布；将培养皿放入温度为15℃的培养箱中培养观察，9～13天后便可发现有明显的菌落出现；

(16)在超净工作台中向体积为25mL的锥形瓶中加入1.5mL原油浓度为15g/L的正己烷溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；

(17)向步骤(16)中的锥形瓶内加入10mL按步骤(11)配制的液体培养基；

(18)在超净工作台中挑取步骤(15)培养皿中的菌落，将其接种至步骤(17)中的锥形瓶中，在温度为10～15℃、转速为100r/min的振荡器中培养4～6天；

(19)将步骤(12)至步骤(18)作为一个分离纯化周期；重复步骤(12)至步骤(18)，但每次用前一个分离纯化周期中步骤(18)的菌液代替步骤(15)中用到的1mL步骤(10)中锥形瓶内的溶液；分离纯化6个周期以上即可得到能够高效去除溢油污染海水中石油烃的降解纯菌株。