[发明专利]不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用实时荧光PCR技术检测水体和食品样品中O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌和非O1/非O139群霍乱弧菌的试剂盒及方法。尤其涉及检测所使用的特异性引物和探针序列。

背景技术

对霍乱疫区的外环境水体和食品样品进行霍乱弧菌监测是霍乱防治工作的重要组成部分，监测结果可对评价外环境水体中霍乱弧菌污染状况、制订霍乱防控策略提供科学依据，另外，对环境水体和食品样品中的霍乱弧菌的监测可作为霍乱流行的预警指标。水体和食品样品中的霍乱弧菌检测通常是采用传统的碱性蛋白胨增菌法，国家卫生部编制的《霍乱防治手册》及GB15984-1995《霍乱诊断标准及处理原则》首选方法也是此法。但在霍乱的非流行期，霍乱弧菌在外环境水体中自然生存状态下菌量较少，同时由于外环境水体中存在大量其它杂菌，会对霍乱弧菌的分离鉴定产生干扰；并且水体中含有大量的有机物，常规法在增菌过程中有机物在微生物的作用下pH值迅速降低，严重抑制着霍乱弧菌的生长，致使霍乱弧菌不易检出而容易出现假阴性，造成在疫情监测和调查中产生误差，不适应烈性传染病的监测需要。

因此，有必要研究一种方法，可同时针对不同血清型霍乱弧菌进行快速且大批量检测。在PCR反应中使用一对以上的引物和不同荧光标记物的探针进行检测的多重实时PCR技术在同一样品的多种致病菌检测中已经有一定的应用，但现有技术中还未见有针对霍乱弧菌不同血清型检测的多重实时PCR技术；另外，Taqman MGB探针是在Taqman探针基础上提出的一种新型分子探针，它的荧光淬灭基团是一种基本无荧光本底的小沟结合物，降低了本底，可以用较短的探针达到更好地分辨效果，增加了对指定目标检测的可靠性，可以更好的实现多重实时PCR反应。本发明人旨在建立利用多重实时PCR技术快速、准确、灵敏检测水体和食品样品中不同血清型霍乱弧菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法。

本发明所述的不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒中包括如下引物和探针：

①霍乱弧菌的O1群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB)-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3′；

③霍乱弧菌的O139群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)-3′。

所述的试剂盒中还包括其它用于PCR扩增的试剂，这些试剂本领域的普通技术人员可以根据现有技术选择使用。

本发明另一方面的目的在于提供一种不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测方法，主要针对食品和水体中存在的霍乱弧菌。所述方法使用上文所述本发明的检测不同血清型霍乱弧菌的试剂盒，是利用特异性引物和探针进行多重PCR(m-PCR)扩增，并以扩增结果进行判定的方法。

所述方法包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：总体积20ul，包括步骤①制得的模板DNA溶液2μl，2×PCR TaqmanGEx酶预混液10μl，霍乱弧菌的O1群rfb基因上下游引物各0.8μL、探针0.4μL，霍乱弧菌的hlyA基因上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，霍乱弧菌的O139群rfb基因上下游引物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水4.0μl；其中各引物和探针的浓度均为10μM；