[发明专利]一种疱疹病毒Ⅰ型PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)属于疱疹病毒科α病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和单纯疱疹病毒II型(HSV-II)。I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。HSV-I与HSV-II容易发生交叉性感染。单纯疱疹病毒感染是由于人与人的接触。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50-90％，是最易侵犯人的一种病毒，可引起口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等，有时也是脑膜炎、脑炎的病因。口唇部疱疹一般较易诊断，同时因日晒、发热等种种的刺激因素而引起复发。

单纯疱疹病毒侵入宿主细胞后，病毒DNA进入细胞核内复制，与此同时，病毒DNA转录物进入胞质，指导病毒结构蛋白在细胞质内的合成；随后，子代病毒DNA回到胞质内装配为具有感染性的成熟病毒颗粒。单纯疱疹病毒入侵后，可在入侵局部造成感染；但一般情况下，病毒沿该局部的神经末梢上行，传入至神经节内，经2～3天短暂时间的复制后，病毒进入潜伏感染状态健康搜索。在适当条件下，单纯疱疹病毒可被激活而大量复制，再沿该神经节的神经分支下行播散到外周支配区域组织的细胞内，导致疱疹发作。局部感染较重时，病毒可沿淋巴管上行扩散导致淋巴结炎；在机体免疫功能低下时，可形成病毒血症，发生全身播散性感染。其感染的重要特点是，病毒可长期潜伏于体内，其间可因受激惹而反复发作。

目前，HSV常用的检查有培养法、PCR试验、血清学检查及其他抗原试验等多种选择。培养法仅能检查症状的患者，在检查无症状患者样本时，其敏感度仅有20％～50％，这使得80％以上的HSV感染者直接被漏检。同时培养法也非常耗时，且需要专门的设备。由于以上问题和具有很高的特异性，培养法一般用于HSV的确诊和法医学鉴定。在细胞学检查中，可检出HSV感染特征性的多核巨细胞内的嗜酸性包涵体，但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60％。另外，免疫酶方法(ELISA)是一种将抗原的特异性和酶的生物学放大作用有机结合在一起的特异而敏感的免疫学检测方法，但在快速和定量检测自动化上仍有较多工作做。免疫荧光法(IFA)在检查无症状患者样本时，其敏感度可达到35％～70％，且可以在几个小时内出报告。但该方法目前的主要问题是其结果判断的经验依赖性较高。乳胶凝集试验(LA)是将特异性的抗体与乳胶颗粒结合成复合物，当有HSVAg存在时，就会形成抗原-抗体-胶乳聚合物，出现肉眼可见的凝集.问题是敏感性较差。

随着分子生物学的发展，转录介导的扩增试验、酶放大免疫反应、半巢式PCR-微空板杂交法、巢式PCR、实时荧光PCR定量检测等方法都在应用，提高了检测的准确性和敏感性，为临床提供了无创、灵敏、快速的检测手段，可用于筛查试验。

发明内容

本发明目的是提供一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，检测临床样品中单纯疱疹病毒I型特有的核酸序列，从而达到快速判断单纯疱疹病毒I型存在的目的。

为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种疱疹病毒I型PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括DNA提取液，PCR反应液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物：

上游引物：5’-GAGACGCTGATGAAGCGCGAACTGA-3’；

下游引物：5’-ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGAGCT-3’；

荧光探针：5’-FAM-TGACGAGGCCGCAGCTCACCAAG-TAMRA-3’。

作为本发明的进一步设置，本发明试剂盒引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针、引物和内参DNA，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，所述内参照系统包括上游引物序列：SEQ ID NO.5、下游引物序列：SEQ ID NO.6和探针序列：SEQ ID NO.7。

作为本发明的进一步设置，所述阳性质控品浓度为10倍梯度10⁶copies/mL-10⁷copies/mL，所述弱阳性质控品浓度为10³copies/mL-10⁴copies/mL。