[发明专利]一种水通道蛋白基因在构建与Hpa1Xoo相互作用的互作载体中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种水通道蛋白基因在构建与Hpa1_Xoo相互作用的互作载体中的应用。

发明背景

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子和一些小分子溶质的膜内在蛋白，属于MIP(major intrinsic protein)超家族，分子量在23～31ku。AQP1蛋白就是一个存在于哺乳动物中的只传输水分子的典型水通道蛋白。根据N、C端序列保守性，相继鉴定出拟南芥水通道蛋白PIP1和PIP2。到目前为止，在拟南芥、烟草、玉米、豌豆、水稻、大麦叶表皮、滨藜、番茄跟、甜菜贮藏组织、西葫芦种子及向日葵下胚轴薄壁细胞等多种植物中都发现了水通道蛋白，并且真细菌、古生菌、真菌和动物等生物中也有AQP的存在。另外，从蛋白数据库中也发现了大量AQP的同源物，它广泛存在于单子叶和双子叶植物、C3和C4代谢植物中。根据氨基酸序列的同源性分析，它们可能也是AQP。越来越多的研究表明，植物中往往存在多个AQP同源物且含量丰富，有时甚至是细胞膜的一个主要成分。如菜豆子叶中含丰富的α-TIP同源物，约占细胞可抽提总蛋白的2％；在拟南芥中，PIP1蛋白占叶与根质膜蛋白的1％以上；菠菜叶肉细胞中含丰富的质膜AQP，占其质膜总蛋白的20％。水通道蛋白有不同的孔结构，能转运活性氧、气体和一些代谢产物。harpins能激活植物生长和防卫反应信号通路，但是植物中一个harpin蛋白在一个信号通路中是如何被识别的？一个特定harpin的植物受体是什么？这个信号是如何被转导到细胞内的？能把细菌效应蛋白，特别是III型效应子从植物细胞外转运到细胞内的植物转位子是什么？目前都还不清楚。

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，研究蛋白质与蛋白质互作的方法也越来越多，体内实验如普通的Y2H、MYTH、荧光共振能量转移、BiFC和蛋白质片段互补技术等，体外实验如免疫共沉淀、Pull-down assay和表面等离子共振等。

酵母双杂交系统是一个在生物学领域具有划时代意义的研究方法，由Fields和Song等首先在研究真核基因的转录调控起始过程中建立的。因其具有简便、灵敏、高效以及能反应不同蛋白质间在活细胞内的相互作用等特点，因此在基因功能的研究中得到了广泛的应用。其基本原理是真核生物转录的起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分割开的结构域，即DNA结合域(DNA-binding domain，BD)与转录激活域(Transcriptional activation domain，AD)(Fields and Song，1989)。这两个结构域各具功能，互不影响，单独的BD虽然能和启动子结合，但不能激活转录。一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。所以可将编码已知蛋白质(常称为诱饵蛋白质，bait protein)的基因与BD融合，在酵母中表达产生融合蛋白质称为BD-Bait；编码未知蛋白(常称为捕获蛋白质，prey protein)的基因与AD融合，并在酵母中表达产生另一融合蛋白称为AD-Prey。把这两种融合蛋白共表达于宿主细胞中，如果这两个蛋白能发生相互作用，AD与BD就会形成一个完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因的表达。反之，如果待测蛋白间不发生相互作用，则BD和AD不能结合，报告基因的转录也就不能被激活。如果将Prey换成基因文库，即可直接从基因文库中筛选到能与Bait相互作用蛋白的基因。

膜酵母双杂交(membrane yeast two hybrid)利用的原理十分巧妙，应用到了分离泛素系统(split-ubiquitin)，将“诱饵”(bait)即一个完整的膜蛋白，融合到泛素的C末端(这部分的泛素与一个转录激活因子相连)，而“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)则融合在泛素的另一半上，bait和prey的相互作用就会让这两部分的泛素重新构成泛素，从而被一种特异性的蛋白酶(泛素专一性蛋白酶，UBPs)剪切，释放出转录激活因子，这个转录因子转移到细胞核上，开启报告基因的表达。DUAL membrane(Stagljar et al.，1998；Thaminy et al.，2003)体系利用切割-泛素机制来验证一个完整的膜蛋白与另一个蛋白(完整的膜蛋白或可溶性蛋白)的互作。因为自然状态下这种互作是在膜上检测到的，所以与普通的Y2H相比这个方法更符合生理学的状态，普通的Y2H仅仅能验证完整膜蛋白的亚结构域与其他蛋白质的互作，并且互作发生核内。