[发明专利]化学合成的HBV 1.2x基因组、表达系统及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及是关于一种化学合成的HBV 1.2x基因组、表达系统及其构建方法。

背景技术

合成生物学是新生交叉学科，对生命过程或生物体进行有目标的设计、改造、重新合成改造乃至重新合成，有助于解决生物医药、环境能源、生物材料等问题，对于解决国计民生相关的重大生物技术问题有着长远的战略意义和现实意义。一般的合成过程是：把目标DNA序列分成大小不同的DNA的片段，化学合成每段寡核苷酸，寡核苷酸包含与其它寡核苷酸的重叠片段，经过PCR和连接酶链反应，得到全长的DNA，由测序验证保证序列100％准确。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种不依赖天然模板、可以根据需要改造的化学合成的HBV1.2x基因组、表达系统及构建方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种化学合成的HBV1.2x基因组，所述HBV 1.2x基因组的DNA序列为SEQ ID NO：1所示的第一序列。

进一步的，所述第一序列由SEQ ID NO：2所示的第二序列改造而成，所述第二序列的1501-3215片段和1-2150片段构成改造序列，改造序列对应第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，其中1501-3215片段的第1909个核苷酸由T突变为C、第1912个核苷酸由C突变为T、第2248个核苷酸由T突变为C，在改造序列(对应第二序列的1501-3215，1-2150，其中包含上述三个突变点)的两端均加入序列GATATC(即EcoRV酶切位点)得到所述第一序列。

一种HBV基因型/基因亚型表达系统，包括表达载体及克隆到所述表达载体的所述的HBV 1.2x基因组。

所述表达载体是pcDNA3.1。

一种所述的表达系统的构建方法，包括如下步骤：

a)获得HBV 1.2x基因组，所述HBV 1.2x基因组的DNA序列为SEQ ID NO：1所示的序列；

b)将所述HBV 1.2x基因组克隆到真核表达载体；

c)转染人肝癌细胞株HepG2细胞，得到所述表达系统。

一种HBV基因型/基因压型快速诊断试剂盒，包括重组质粒，所述重组质粒包括真核表达载体及插入所述真核表达载体的所述的HBV 1.2x基因组，所述重组质粒的HBV基因型/基因亚型特异性片段用作阳性对照模板。

本发明的有益效果是：本发明不用依赖天然模板，而且可以根据需要进行改造；本发明HBV 1.2x基因组构建重组质粒pcDNA3.1(+)/HBV，然后转入肝肿瘤细胞系HepG2细胞，培养上清中检测到HBV特异性抗原HBe Ag和HBs Ag，从而能够实现HBV特异性抗原的表达。

附图说明

图1是本发明重组质粒pcDNA3.1(+)/HBV结构示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明HBV 1.2x基因组是由现有HBV基因组改造，本发明HBV 1.2x基因组的序列为SEQ ID NO：1所示的第一序列，现有HBV基因组的序列为SEQ ID NO：2所示的第二序列。现有HBV基因组的相关信息如下：HBV subtype C2，genotype C；GenBank：FJ899789.1。改造序列对应第二序列的1501-3215片段和1-2150片段，其中1501-3215片段的第1909个核苷酸由T突变为C、第1912个核苷酸由C突变为T(该位点可以作为Clal酶切位点)、第2248个核苷酸由T突变为C(该位点可以作为Xhol酶切位点)，然后在突变后的改造序列的两端均加入序列GATATC(该两端可以作为EcoRV酶切位点)，得到第一序列。

如图1所示，把合成得到的第一序列插入到pcDNA3.1(+)的EcoRV位点，构建重组质粒pcDNA3.1(+)/HBV，然后转入肝肿瘤细胞系HepG2细胞，培养上清中检测到HBV特异性抗原HBeAg和HBsAg，其检测结果如表1所示：

表1 ELISA检测转染细胞上清液特异性分泌蛋白

Note：sample-to-negative ratio≥2.1was considered as a positive response to HBsAg or HBeAg antigen。