[发明专利]一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，尤其是一种应用微载体结合Hyperflask在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法。

背景技术

近年来有关干细胞的研究日益深化，随着相关知识的不断积累干细胞成为人类对抗疾病的全新的武器。目前，关于干细胞多向分化能力的研究发现可以将来源于不同组织的干细胞应用于器官、组织疾病的治疗，例如比较容易获得的造血干细胞和间充质干细胞已经被广泛的应用于不同组织的各种疾病的治疗研究，并且在治疗心血管疾病、神经损伤疾病以及代谢疾病方面取得了比较令人振奋的结果。

但是，在干细胞的临床应用过程中如何获得大量的细胞成为了关键问题，并且也成为了瓶颈问题，因为无论是造血干细胞或者脐带间充质干细胞在细胞数量上都是有限的。关于如何在体外大量扩增干细胞的研究越来越受到研究人员的重视，虽然也取得了一定的进展但远不能达到临床应用的需求。

Hyperflask是康宁公司的一个新式细胞培养容器，其体积与T175细胞培养瓶相当，却可以提供10倍T-175的培养面积，适合贴壁细胞的大规模培养扩增。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种充分利用hyperflask系统的优势，应用微载体结合Hyperflask在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，应用微载体结合Hyperflask细胞培养容器在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞。

具体包括以下步骤：

1)微载体的预处理：适合于细胞表面贴壁生长的微载体以无钙、镁磷酸盐缓冲液PBS清洗2次后加入足量PBS水合3小时后按照5g/L的浓度配制成微载体母液，高温蒸汽灭菌30分钟后补加细胞培养用水到原浓度；

2)微载体的保存：高压灭菌后的微载体分装入洁净的离心管中，于4℃保存；

3)细胞接种：在离心管中按照1*10⁵细胞/ml加入细胞以及适量细胞培养基，在另一个离心管中按照5mg/100ml加入全量微载体以20mlPBS清洗两次后尽量吸弃PBS并加入细胞悬液充分混匀后，在CO₂培养箱中孵育30分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次，最后将混合液按照培养瓶的体积加入细胞培养瓶中，放入CO₂培养箱中培养；

4)细胞培养、换液：将接种好的细胞在细胞培养箱中静置培养，按照每天半换液、每3天全换液的方法持续培养，在进行全换液时将所有微载体以PBS清洗两次后加入新鲜培养基；

5)细胞的传代以及扩大培养：显微镜下观察当微载体上细胞生长达到最大密度时，将所有微载体回收后，以PBS清洗2次后按照1/6扩大培养，补加5/6量的新鲜微载体和足量的细胞培养基；

6)Hyperflask大规模培养：将初步放大培养的细胞经PBS清洗两次后，加入560ml完全培养基和以及按照5mg/100ml补加微载体后，充分混合，移入Hyperflask中继续扩大培养；

7)细胞的回收、计数以及活率统计：待微载体上细胞生长达到最大量时，将全部的微载体回收以PBS清洗2次后再以PBS-EDTA清洗2次后加入胰酶-EDTA消化至细胞全部脱落，对回收的细胞进行细胞计数以及计算活率。

所述PBS-EDTA含有质量百分比0.2％EDTA；所述胰酶-EDTA为质量百分比0.5％胰酶+0.2％EDTA+99.3％PBS。

本发明的有益效果是：应用商品化微载体结合Hyperflask在体外能够在较小的培养空间中大量的扩增细胞，从而在节约成本的前提下大量的获得目的细胞。微载体培养结合Hyperflask培养技术一定程度上克服了最初的转瓶培养的不足，具有很多优点：

1)不需要额外的细胞培养设备-转瓶培养箱。

2)操作简单，应用常规的细胞培养设备可以完成。

3)相同的培养体积下可以获得更多的细胞。

4)节省培养基、血清、胰酶用量。

5)细胞传代简便。

6)兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养。

7)细胞所处环境均一。

8)环境条件(温度、pH和CO₂等)容易测量与监控。

9)具有较高的比表面积。

附图说明

图1微载体培养COS1细胞

图2微载体培养rADSC细胞