[发明专利]一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，其特征在于，应用微载体结合Hyperflask细胞培养容器在体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)微载体的预处理：适合于细胞表面贴壁生长的微载体以无钙、镁磷酸盐缓冲液PBS清洗2次后加入足量PBS水合3小时后按照5g/L的浓度配制成微载体母液，高温蒸汽灭菌30分钟后补加细胞培养用水到原浓度；

2)微载体的保存：高压灭菌后的微载体分装入洁净的离心管中，于4℃保存；

3)细胞接种：在离心管中按照1*10⁵细胞/ml加入细胞以及适量细胞培养基，在另一个离心管中按照5mg/100ml加入全量微载体以20mlPBS清洗两次后尽量吸弃PBS并加入细胞悬液充分混匀后，在CO₂培养箱中孵育30分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次，最后将混合液按照培养瓶的体积加入细胞培养瓶中，放入CO₂培养箱中培养；

4)细胞培养、换液：将接种好的细胞在细胞培养箱中静置培养，按照每天半换液、每3天全换液的方法持续培养，在进行全换液时将所有微载体以PBS清洗两次后加入新鲜培养基；

5)细胞的传代以及扩大培养：显微镜下观察当微载体上细胞生长达到最大密度时，将所有微载体回收后，以PBS清洗2次后按照1/6扩大培养，补加5/6量的新鲜微载体和足量的细胞培养基；

6)Hyperflask大规模培养：将初步放大培养的细胞经PBS清洗两次后，加入560ml完全培养基和以及按照5mg/100ml补加微载体后，充分混合，移入Hyperflask中继续扩大培养；

7)细胞的回收、计数以及活率统计：待微载体上细胞生长达到最大量时，将全部的微载体回收以PBS清洗2次后再以PBS-EDTA清洗2次后加入胰酶-EDTA消化至细胞全部脱落，对回收的细胞进行细胞计数以及计算活率。

3.根据权利要求2所述的体外大量扩增细胞系以及间充质干细胞的方法，其特征在于，所述PBS-EDTA含有质量百分比0.2％EDTA；所述胰酶-EDTA为质量百分比0.5％胰酶+0.2％EDTA+99.3％PBS。