[发明专利]制备转基因动物的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备转基因动物的新方法。具体而言，将含有外源基因的真核表达载体，制备成转染液。采用卵泡及卵巢注射法将转染液注射到雌性哺乳动物的成熟卵泡及卵巢中，在雌性哺乳动物发情时进行人工受精，得到子代转基因绵羊。

背景技术

转基因技术是近年来研究最热门、发展最快的领域之一。所谓转基因动物就是指用试验的方法将人们所需要的外源基因导入到动物体内，使这种外源基因与动物本身的染色体整合在一起，这样外源基因就能随着细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并且能够稳定遗传给后代的动物。

1976年，Jaenisch首次利用反转录病毒感染胚胎的方法获得了转基因小鼠[Jaenisch R.Germ line integration and Mendelian transmission of exogenous Monloney leukemia virus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1976，(73)：1260.]。1980年Gordon等人采用受精卵原核显微注射的方法，将外源基因导入小鼠受精卵，获得了转基因小鼠[Gordon J W，et al.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1980，77(12)：7380-7384.]。1997年，克隆羊Dolly的诞生[Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature，1997，385(6619)：810-813.]，开创了哺乳动物体细胞核移植技术的先河，随后乳腺中表达人凝血因子IX的转基因克隆羊Polly培育成功。2005年抗乳房炎转基因牛的诞生，标志着转基因动物育种进入了新的发展历程，转基因动物技术自从诞生以来就在改良家畜生产性状、提高家畜抗病力以及生产非常规畜牧产品(如人药用蛋白和工业用酶)等方面显示了广阔的应用前景。随着基因工程技术的不断发展，转基因动物技术将会不断得到完善，从而在未来的动物育种中将发挥巨大的作用。

生产转基因动物的常用方法有：原核期胚胎显微注射法、胚胎干细胞介导法、精子介导法、慢病毒载体法等。

原核内显微注射是由美国人Gordon发明的，是发展最早、目前应用最广泛的方法之一。这种方法的优点是外源基因易整合入染色体，导入的基因大，可使用任何载体承载基因片段，也可注射无载体的基因片段，外源基因的长度可达100kb，实验周期相对比较短。其缺点是：由于基因整体进入染色体的随机性，使外源基因整合位点和拷贝数无法控制，外源基因随机整合到基因组内常导致宿主DNA中的染色体序列丢失、重排、插入、突变，有的甚至造成严重生理缺陷，而且设备昂贵、操作复杂。该方法的外源基因转移整合率较低，如：小鼠为6％～10％，猪和羊分别为0.98％和1％。

胚胎干细胞是早期胚胎的内细胞团或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，具有全能性，在一定条件下可发育成完整个体。因此，把外源基因导入干细胞后，经过选择，再把阳性细胞注入另一胚胎囊胚腔中，或与另一胚胎卵裂球聚合，再经过选育即可得到转基因动物。在转基因领域，胚胎干细胞是公认的研究基因转移、基因定点整合极有前途的实验材料，利用这种方法制作转基因小鼠的阳性率接近100％，遗憾的是第一代一般是嵌合体，要通过杂交繁育才能得到纯合目的基因的个体。另外截至目前世界范围内只有小鼠干细胞的建系方法比较成熟，大鼠、兔、猪、牛的胚胎干细胞系虽有建立，却尚未得到应用。