[发明专利]人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法

说明书

技术领域

本专利涉及一种生物合成的方法，特别涉及到人血清蛋白与抗肿瘤因子的融合方法。 

背景技术

抗肿瘤因子是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，是所有细胞因子中唯一具有直接杀伤肿瘤细胞的因子。抗肿瘤因子能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无不良影响。对抗肿瘤因子敏感的肿瘤细胞表面存在抗肿瘤因子受体，抗肿瘤因子通过与该受体结合，引发细胞的一系列变化，最终导致肿瘤细胞的死亡。研究发现，抗肿瘤因子经过抗肿瘤因子R的识别、结合、内吞，导致一系列的变化，膜蛋白特异性磷酸化，产生大量热能，溶酶体酶类高度活化，膜通透性增加，蛋白酶类溢出，导致细胞溶解；也有证据表明，抗肿瘤因子与受体结合后可使细胞的线粒体产生的自由基增加，使质膜过氧化，引起细胞损伤。 

抗肿瘤因子与受体结合后，可通过细胞内的一系列级联反应，诱导肿瘤细胞凋亡。抗肿瘤因子直接抑制细胞生长的作用也通过肿瘤细胞表面的特异性受体介导。主要通过影响其蛋白质的代谢，导致肿瘤蛋白质合成减少，分解增加，从而抑制肿瘤生长。

肿瘤的血液供应丰富，对血液供应减少较为敏感。抗肿瘤因子除了对肿瘤细胞具有细胞毒性作用之外，更重要的是它能摧毁实体瘤周围的血管上皮组织，并且通过血栓的形成，阻断肿瘤的血液营养供应，最终导致肿瘤的出血性坏死、消退和消失。

抗肿瘤因子是一种细胞因子，它对人体免疫系统具有很重要的调节作用。例如，抗肿瘤因子对免疫细胞树突状细胞具有催熟作用，具有激活和刺激T细胞作用。抗肿瘤因子可导致肿瘤局部的炎症反应，增强单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤作用，增强T细胞的增殖和杀伤作用，还可诱导产生其他细胞因子如IL-2、IFN等，通过“级联反应”发挥更强昂的杀肿瘤活性。另外，抗肿瘤因子通过对核内基因的调控，促进肿瘤抑制基因P53的表达，从而加强机体自身的抗肿瘤作用。

人血清白蛋白（HSA )本身是许多内源因子和外源药物的载体，药物和人血清白蛋白结合后，可以在减少其生物利用度的同时增加其在体内的半衰期。这是由于HSA本身是一种大分子蛋白，不易被肾小球滤过，并可抵御生物体内酶的作用，它还是一个稳定的 “惰性”蛋白，因而蛋白药物与其融合后可以提高药物的稳定性，延长蛋白药物在体内的半衰期。另外HSA 的表达水平较高，与其融合后可以提高目的蛋白药物的表达水平。

发明内容

本发明的提供一种人血清白蛋白与肿瘤坏死因子的融合的方法，它可以延长药物在体内的半衰期，减小毒性，从而提高抗肿瘤的效果，提高产量。

    为完成上述发明的目的，本专利是这样实现的：一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）基因扩增及表达菌株的构建；

    用T₄DNA 连接酶将目的人血白蛋白基因片段与载体连接，连接产物转化大肠杆菌菌株和毕氏酵母菌，挑取阳性克隆，电泳验证结果；

(2)诱导表达；

    分别挑取重组体单菌落接种于大肠杆菌LB培养基中和酵母菌YPD培养基中，振荡过夜培养诱导表达，产生融合蛋白；

（3）表达产物分析取发酵液上清进行SDS-PAGE 分析，并进行Western-blotting分析 ；

(4)产物体外生物活性测试，细胞测活，生物学活性并与对照品对比。

对上述技术方案作进一步的改进，所述的人血白蛋白基因片段的基因序列如图1所示。

对上述方案作进一步的细化，采用PCR方法进行聚合酶链反应，用设计的引物合成上述人血清白蛋白基因。

对上述方案作进一步的细化，上述人血清蛋白基因的引物设计为：

上游：GC GGATCC  AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC；

下游：GC GAATTC  CTC GGC AAA GCA GGT CTC CTT 。

TNF基因信息为图2。

.TNF引物设计：

上游：GC GAATTC  ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA ；

下游：GC CTCGAG  TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA 。

.TNF基因信息为图2。

所述的.TNF引物设计为：

上游：GC GAATTC  ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA ；