[发明专利]循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法及试剂盒

权利要求书

1. 循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测方法，其步骤包括，

(1) 从乳腺细胞，包括癌细胞和正常细胞中提取乳腺球蛋白mRNA；

(2) 准备与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，其中第一适配体和第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体和第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜在可能性；

(3)将步骤（1）中的偶联的适配体与待检测、鉴定和/或定量的样品混合及进行磁性分离，

(4) 检测磁性分离产物。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)为：将与磁性颗粒偶联的第一适配体、纳米金颗粒偶联的第二适配体同时与待检测、鉴定和/或定量的样品混合及进行磁性分离。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤 (3) 为：

①将磁性颗粒偶联的第一适配体与待检测、鉴定和/或定量的样品混合；

②进行磁性分离，收集磁力吸附所得的产物；和

③混合磁力吸附所得的产物和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，然后进行磁性分离。

4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中乳腺球蛋白是人乳腺球蛋白，其mRNA优选如SEQ ID No.:1所示。

5. 根据权利要求4所述的方法，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。

6. 根据权利要求5所述的方法，其中第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如SEQ ID No.2所示，是5’-aaggaagccgctgtc- 3’，而且第二适配体如SEQ ID No.3所示，是5’-aataaacatgatagc- 3’。

7. 根据权利要求1、2、3、5或6任一项所述的方法，其中第二适配体是用检测标记物标记的，如生物素、放射性同位素、金属标记物、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、抗原或抗体、配体或受体中的一种或多种组合。

8. 根据权利要求7所述的方法，其中检测标记物是生物素。

9. 根据权利要求8所述的方法，其中第二适配体是通过生物素与链球菌亲和素-辣根过氧化酶包被的纳米金颗粒偶联。

10. 根据权利要求1-3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中磁性分离产物是磁力吸附所得的产物。

11. 根据权利要求1-3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中磁性分离产物是经过洗涤的。

12. 根据权利要求1-3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中进行步骤(3)的温度为20-42℃。

13. 根据权利要求12所述的方法，其中进行步骤(3)的温度优选为37℃。

14. 根据权利要求1-3、5、6、8、9任一项所述的方法，其中步骤(3)的缓冲液为Tris-HCl、PBS或含Mg离子的PBS。

15. 循环血中微量乳腺癌细胞的特异性检测试剂盒，其包括与磁性颗粒偶联的第一适配体和与纳米金颗粒偶联的第二适配体，其中第一适配体与第二适配体是分别与乳腺球蛋白mRNA的不同部位特异结合的适配体，而且第一适配体与第二适配体无互补核酸序列而且无相互杂交结合的潜能。

16. 根据权利要求15所述的试剂盒，其中第一适配体和第二适配体之一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第1-30位上，而且第一适配体和第二适配体之另一的结合部位位于人乳腺球蛋白mRNA的第470-490位上。

17. 根据权利要求15所述的试剂盒，其中第一适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，而且第二适配体与乳腺球蛋白mRNA的同一性小于30%，最优选第一适配体如SEQ ID No.2所示，是5’-aaggaagccgctgtc- 3’，而且第二适配体如SEQ ID No.3所示，是5’-aataaacatgatagc- 3’。