[发明专利]克伦特罗单克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种克伦特罗的特异性单克隆抗体的制备，并用于对饲料及动物性食品中克伦特罗的快速测定，属于检测技术领域。 

背景技术：

克伦特罗又叫瘦肉精，属β-肾上腺素受体激动剂类(简称β-激动剂)药物，具有促进动物肌肉生长，减少胴体脂肪含量，改善饲料利用率，显著提高瘦肉率的作用，是最为实用的β-激动剂之一。克伦特罗在家畜和人体内吸收好，而且与其它β-兴奋剂相比，它的生物利用度高，以至食用了含有克伦特罗的猪肉出现中毒。早在1986年欧洲就颁布禁用β-激动剂的禁令。我国农业部与质检总局也全面禁止该类物质的使用。瘦肉精在上海曾经引发了几百人的中毒事件。而在台湾，由于从美国进口的猪肉里含有瘦肉精，几乎挑起一场政治争端。 

近年来虽加大了打击非法使用瘦肉精的力度，但在经济利益的驱使下，仍有很多非法使用瘦肉精的情况发生。为了打击非法使用违禁药物，除了健全法律法规，建立有效的监督管理体系外，还需要健全相应的检测方法。申请人通过检索发现，目前国内报道所制备的克伦特罗单克隆抗体的特异性不强，在以单抗为核心所制备的胶体金试纸条的应用中，未见对不同检测样品的处理方法及最低检测浓度的报道，且目前市场上的试纸条假阳性率偏高。因此克伦特罗的检测远远不能满足快速、廉价、稳定和准确等方面的要求。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法及其在检测克伦特罗上的应用。 

为实现本发明的目的，技术方案通过如下方式实现： 

一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于：以盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白的偶联物为免疫原免疫小鼠，再通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞，诱生腹水制备出克伦特罗单克隆抗体。 

所述免疫原是通过重氮法合成的。 

一种克伦特罗单克隆抗体的应用，其特征在于：以克伦特罗单克隆抗体为核心试剂制备检测克伦特罗的胶体金免疫试纸条。 

所述胶体金免疫试纸条由PVC底板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫几部分组成，其中胶体金结合垫包被有克伦特罗的胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有克伦特罗-载体蛋白偶联物构成的检测线(T)和包被羊抗鼠IgG构成的质控线(C)。 

所述胶体金免疫试纸条，检测饲料中克伦特罗的最低浓度为0.005mg·kg^-1，动物肌肉和肝脏中克伦特罗的最低浓度为1.6ng·g^-1，猪尿中克伦特罗的最低浓度为1.5ng·mL^-1；检测时以控制线(C)和检测线(T)两条显色线作为结果判断的主要依据。 

1.人工免疫抗原和包被抗原的制备 

精确的称取定量的盐酸克伦特罗溶解在适量的HCl边震荡边向其中缓缓加入NaNO₂，并不断用微量移液器蘸取少许与淀粉碘化钾试纸检测，直到试纸颜色刚好变为蓝紫色，停止加NaNO₂，继续震荡使反应充分进行就得到了重氮化的克伦特罗溶液，将重氮化合物分别缓慢加入牛血清白蛋白和卵清蛋白中，震荡反应。4℃冰箱继续放置6h后，在4℃冰箱中用PBS连续透析3天。 

2.克伦特罗单克隆抗体制备及鉴定 

(1)动物免疫程序：将1100μg·mL^-1CL-BSA的PBS溶液(0.22μm滤膜过滤除菌)与等体积弗氏完全佐剂混合成乳剂，皮下分点注射健康6周龄雌性BALB/C小鼠，每只0.4mL(含CL-BSAl00μg)，首免2周后同样剂量加强免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，共免3次，每次间隔2周，间接ELISA法监测血清抗体效价，选择效价最高的小鼠进行细胞融合，融合前三天以CL-BSA对小鼠进行加强免疫注射。 

(2)细胞融合与克隆化：取经过加强免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过多次亚克隆获得稳定分泌抗克伦特罗的单克隆抗体细胞 株5G8。 

(3)单克隆抗体制备、纯化及鉴定：取8～10周龄的BALB/c小鼠，用灭菌石蜡对小鼠进行免疫，10天后腹腔注射所述单克隆抗体细胞株5G8，注射量为5×10⁵个/只，待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，用辛酸-硫酸铵盐析法及Protein A免疫层析法对腹水纯化，即得克伦特罗单克隆抗体。 

通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgG1型。采用间接竞争ELISA测定抗体特异性及其与同类其它化合物的交叉反应性。 

3.克伦特罗胶体金免疫试纸条的研制