[发明专利]一种猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法

说明书

技术领域

    本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪细小病毒基因工程疫苗的制备方法。

背景技术

    猪细小病毒( Porcine parvovirus, PPV)是一种自主复制型病毒，是引起母猪产畸形胎的主要因素之一，通常初产母猪感染PPV之后可引起繁殖障碍，主要表现为流产、不孕、产死胎和木乃伊胎等，给养猪业带来重大的经济损失。PPV、猪圆环病毒( PCV) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)一直是猪病研究的热点，最近研究发现PPV在猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)中扮演着重要角色。

PPV基因组为单链线状DNA分子，大小约为5000个核苷酸，成熟的病毒粒子仅含有负链DNA 基因组。研究发现，PPV同细小病毒属的其他细小病毒的基因组有很高的同源性。此外，PPV 的基因组结构与其他细小病毒相似，两端有发夹结构，3′端有一个102 bp的回文序列折叠形成的“Y”字型发夹结构；5′端有一个127 bp的回文序列、中间被一个24 bp的短回文序列中断并折叠形成的“U”字形发夹结构,这种末端结构对其复制是非常重要的。基因组有2个开放阅读框架(ORF)，5′端的ORF1编码非结构蛋白(即调节蛋白)，3′端的ORF2编码结构蛋白，结构蛋白是PPV的主要免疫原性抗原。由启动子P4开始转录的NS基因编码3种非结构蛋白NS1、NS2和NS3；由启动子P40开始转录翻译3 种结构蛋白VP1、VP2和VP3,它们的分子质量分别约为83、64、60ku。

目前市场上防制PPV的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。在临床应用中发现灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；（2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险，很难在实践中推广应用。故传统疫苗在防制PPV中暴露出越来越多的问题，一种新型既安全又可靠的基因工程疫苗迫在眉睫。

VP2是构成PPV衣壳蛋白的主要成分，也是中和抗体作用的靶蛋白,含有病毒的主要抗原决定簇，还具有血凝活性。VP2基因编码的多肽能自我装配成类病毒粒子（VLPs），能诱导很强的免疫应答。赵俊龙等研究发现PPV VP2 在60-68,81-88,266-275,351-357和398-404氨基酸处存在抗原位点的优势区域。梁秀丽等发现VP2 蛋白较有可能成为B细胞表位的区段位于N 端第10-18、34- 39、94-103、121-126、137-144、156-165 和209-214 区段。Soren K等学者分析了PPV的抗原结构，发现有9个线性表位均位于VP2中，只有VP2 N端表位能诱导病毒中和抗体，用哺乳动物细胞系表达或用杆状病毒表达时VP2蛋白可形成VLPs。从分离纯化的病毒粒子电镜图中可以找到两种形态的病毒粒子：一种为完整病毒粒子，内含PPV ssDNA；另一种为病毒空衣壳，内无DNA，病毒空衣壳中VP2含量最高，这种“空芯”病毒粒子仍具有很好的免疫原性。2007年，Yi G X等用重组乳酸菌表达了VP2蛋白，其表现出很好的免疫原性。基于上述特点，VP2成为PPV在诊断和免疫学研究方面的热点。

发明内容

    本发明的目的在于根据巴斯德毕赤酵母中高效表达猪细小病毒主要结构蛋白VP2基因，所以以此高表达量的结构蛋白为基础，提供了猪细小病毒基因工程疫苗。

    本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

1. 构建重组酵母表达载体：在GenBank上面查找国际标准弱毒株猪细小病毒VP2基因，序列号：NC-001718，表达载体为pGAPZαA，宿主菌为酵母菌株SMD1168（购自Invitrogen公司），构建pGAPZαA-VP2重组酵母表达载体。PCR扩增出PPV VP2全基因序列，上游引物P1如SEQ ID NO:1所示，下游引物P2如SEQ ID NO:2所示，酶切位点为XhoⅠ和NotⅠ，AAAAGA为Kex2蛋白酶切位点。