[发明专利]一种植株倍性鉴定方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种计数叶片下表皮气孔保卫细胞叶绿体数目的新方法及其应用于小白菜的倍性鉴定，本发明是利用叶绿体在紫外激发光下不需经过染色等处理即发出红色荧光的特性对叶绿体数目进行计数，并以此判断不同来源植株的倍性。

背景技术

小白菜是一种典型的异花（自由）授粉作物，杂种优势明显，利用小孢子培养或花药培养技术获得双单倍体群体（DH）可以快速获得纯系，加速育种进程，但是花药培养或小孢子培养获得的再生植株群体往往是不同倍性水平的混合群体，要进一步利用必须进行倍性鉴定；小白菜自然或人工诱导产生的部分四倍体植株具有较高的经济价值，也可以直接应用于生产，但诱导产生的植株同样是不同倍性水平的混合群体，也必须进行倍性鉴定才能有效地利用。

  在小白菜等芸薹属作物上进行倍性鉴定的常用方法有：根尖染色体计数法、形态学鉴定法和流氏细胞仪测定法。由于染色体较小，染色体计数法比较烦琐，而且费时；形态学鉴定法要等到植株开花后才能得出结论，周期长；流氏细胞仪测定法虽然高效准确，但所需仪器昂贵，成本高。

王羡雪（1980）、杨今后（1990）、张凌媛等（2005）、张菊平等（2007）、袁素霞（2009）等学者在西瓜、桑叶、枇杷、辣椒和甘蓝类蔬菜中的研究证实了气孔保卫细胞叶绿体数目受染色体控制，倍性间叶绿体数差异显著，能够应用于植株的倍性鉴定。这些研究者在进行叶绿体数目计数时都是用一定浓度的碘一碘化钾溶液染色处理后再进行观察，该方法利用的原理是叶绿体中含有的淀粉粒能被碘一碘化钾染成紫黑色。但是在小白菜中一方面保卫细胞中叶绿体较小，另一方面可能是淀粉含量低很难被碘一碘化钾溶液染色因此难以计数。而叶绿体中含有的叶绿素在紫外激发光下无需任何处理即发出红色荧光，通过调节焦距可看清保卫细胞中不同部位的叶绿体，能够很清楚地在400倍镜下进行计数，克服了碘一碘化钾溶液染色法预处理时间延长导致叶绿体解体以及叶绿体间重叠等而影响计数准确性的问题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是：大量植株倍性鉴定成本高、速度慢的问题，发明一种叶片气孔保卫细胞中叶绿体计数并用于鉴定小白菜等十字花科植物的植株倍性的方法。

技术方案：根据染色体倍性与叶绿体数目的相关建立一种小白菜倍性鉴定的新方法——叶绿体数倍性分界法；对不同来源和不同发育阶段的植株叶片（包括子叶、莲座叶和薹生叶）气孔保卫细胞中叶绿体在荧光显微镜下进行观察计数，根据叶绿体平均数确定植株的倍性，叶绿体数少于10个的为单倍体，大于等于10而少于16个的为二倍体，大于等于16个的为四倍体等多倍体。

一种植株倍性鉴定方法及应用，包括：

（1）叶片保卫细胞中叶绿体数目观察和计数：

（2）根据叶绿体平均数以及叶绿体数倍性分界值确定待测植株的倍性。

有益效果：本发明建立了一种叶绿体数目快速计数方法并将气孔保卫细胞中叶绿体平均数应用于小白菜的倍性鉴定，建立了一种叶绿体平均数分界法快速鉴定小白菜倍性的技术体系，与目前技术相比，其优点是：

（1）计数叶绿体数目快速准确，成本降低；（2）取材方便，不受植株来源和所处发育阶段的限制，无论是试管苗还是田间生长的植株，无论是子叶、莲座叶还是薹生叶均可用于倍性鉴定。

四、附图说明

图1为小白菜二倍体对照植株叶片气孔保卫细胞叶绿体

图2为小白菜四倍体对照植株叶片气孔保卫细胞叶绿体

图3为小白菜单倍体植株叶片气孔保卫细胞叶绿体

图4为小白菜二倍体植株叶片气孔保卫细胞叶绿体

图5为小白菜四倍体植株叶片气孔保卫细胞叶绿体

五、具体实施方式

本发明所提供的一种植株倍性鉴定方法及应用，包括：

1、材料与方法：对小白菜二倍体品种华帝、京冠一号、苏州青、苏秀、四倍体苏州青的种子实生苗，以及倍性确知的华冠、华京、青梗和夏绿2号的小孢子培养再生植株，采取第5-7节叶片，撕取下表皮，在荧光显微镜下（×400）观察气孔保卫细胞中的叶绿体并计数，每叶片观察10个气孔，求其平均值。

所有植株抽薹开花后利用花粉母细胞减数分裂过程染色体数目和行为变化进行倍性确定，单倍体花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ形成10个单价体，后期Ⅰ 5/5分离为主，产生的花粉扁平、深度三裂或形状不规则；二倍体花粉母细胞减数分裂终变期和中期Ⅰ形成10个二价体，中期2每极10条染色体，产生的花粉为3裂状；四倍体花粉母细胞较二倍体大，减数分裂正常，中期Ⅰ形成20个二价体，产生的花粉三裂或四裂。