[发明专利]链格孢α-L-鼠李糖苷酶基因及其应用

说明书

发明领域

本发明涉及一种α-L-鼠李糖苷酶基因，尤其涉及一种来源于链格孢的α-L-鼠李糖苷酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。

技术背景

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40)广泛存在于动物、植物和微生物中，能够水解多糖和其他糖苷中的α-L-鼠李糖苷键，在食品、医药及化工领域有重要的应用价值。α-L-鼠李糖苷酶能够水解柑橘类果汁中主要的苦味物质柚苷，大大降低苦味，改进果汁口感；还能够水解葡萄酒中大量的键合态芳香物质，释放出糖苷配基，产生游离的芳香物质，使葡萄酒增香并提高风味。此外，α-L-鼠李糖苷酶在化合物的结构鉴定、改进抗癌药物的活性方面也有广泛应用。

公开号为CN101914451A(申请号为201010220786.X)的中国专利，公开了一种产生α-L-鼠李糖苷酶的链格孢L1(Alternaria sp.L1)菌株、特征、培养方法及其应用于水解柚苷的方法。该菌株已于2010年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3688。链格孢(Alternaria sp.)L1菌株培养简单，遗传性质稳定，水解效率高，酶活稳定，具有很强的工业化生产优势和广阔的应用前景，可应用于食品工业中柑橘类果汁的酶法脱苦等领域。

目前，α-L-鼠李糖苷酶相关研究大多局限于原始酶的纯化和性质研究，其基因克隆尤其是真菌来源酶基因克隆研究很少，仅有3例真菌α-L-鼠李糖苷酶基因报道。α-L-鼠李糖苷酶性质研究主要涉及水解功能，其应用于糖苷合成方面的研究报道较少。因此，获得新的真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因并扩展其在糖苷合成方面的应用具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种来源于链格孢的α-L-鼠李糖苷酶基因及其应用。

一种α-L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因来源于菌种保藏号为CGMCC No.3688的链格孢L1(Alternaria sp.L1)，其全长2046碱基。

一种由上述α-L-鼠李糖苷酶基因编码的α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该序列全长681个氨基酸。

一种插入了上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的表达载体。

上述表达载体为pPIC9K表达载体。

一种插入了包含上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No.1序列表达载体的重组细胞。

上述重组细胞为毕氏酵母GS115。

所述α-L-鼠李糖苷酶在食品、制药领域方面的应用。

上述应用，步骤如下：

将α-L-鼠李糖苷酶基因克隆到pPIC9K表达载体上，转化毕氏酵母GS115(Pichia pastoris GS115)，甲醇诱导高效表达重组α-L-鼠李糖苷酶，应用该酶水解柑橘类果汁中主要的苦味物质柚苷，或以鼠李糖为供体，甲醇、乙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、七叶苷为受体进行转糖基反应。

上述α-L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶为二亚基糖蛋白，聚合体分子量为240±10kDa，单亚基分子量为120±5kDa，用糖酰胺酶-F(PNGase F)处理去除糖链修饰后单亚基分子量为70±5kDa；酶对对硝基苯-α-L-鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR)适宜反应的温度为60-65℃，适宜反应的pH为5.5-7.5；在25℃-60℃范围内保温2h，能够保留80％以上的活性；在pH3.5-9.0的范围内4℃保存12h可以保留75％以上的活性；酶对对硝基苯-α-L-鼠李糖苷的K_m值为1.27mmol/L。

上述α-L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶能够水解柑橘类果汁中主要的苦味物质柚苷，降低果汁苦味。

上述重组酶对pNPR的最适反应温度为65℃；对pNPR的最适反应pH为6.5～7.0。

以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试剂。

本发明有益效果如下：