[发明专利]静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人免疫球蛋白及其制备方法，特别是一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法。

背景技术

巨细胞病毒CMV(Cytomegalovirus)是疱疹病毒科β属的DNA病毒，由巨细胞病毒引起的孕妇、新生儿、器官移植患者、免疫抑制患者感染死亡率可达50％～80％。巨细胞病毒人免疫球蛋白CMV-IgG因能特异中和巨细胞病毒，临床上主要用其治疗孕妇、新生儿、免疫抑制患者及器官移植手术中引发的巨细胞病毒重症感染。普通人群中的巨细胞病毒自然感染率可达80％以上，从健康人群中筛选并采集含高效价巨细胞病毒IgG抗体的血浆，采用特定的分离纯化方法制备巨细胞病毒人免疫球蛋白药物，对于治疗因巨细胞病毒引起的重症感染具有不可替代的临床应用价值。

目前，已上市的特异性人免疫球蛋白类药物大多采用低温乙醇法(Edwin J.Cohn，L.E.Strong，W.L.Hughes JR.，D.J.Mulford，J.N.Ashworthm，M.Melin and H.L.Taylor，J.Am.Chem.Soc.，68(1946)459-475.)进行分离提纯，该法由1946年美国哈佛大学Edwin.J.Cohn教授发明，通过调节工艺中的pH，蛋白浓度，温度，乙醇浓度和离子强度五个参数来实现不同蛋白的分离。长期实践表明，低温乙醇法存在以下几方面的缺陷：首先，乙醇是一种蛋白变性剂，分离过程中易引起IgG结构改变而变性失活，导致效价回收率较低，还可能导致新的抗原决定簇的形成；其次，相比柱层析技术，乙醇沉淀纯化效率较低，通常需要减少蛋白回收率来达到产品的纯度要求，因此工艺过程收率偏低，产品纯度不高；再次，因分离过程通常需在低温条件下进行，还存在硬件及运行成本高，劳动强度大等缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法，要解决的技术问题是提高产品的纯度、收率及安全性。

本发明采用以下技术方案：一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白，所述静注巨细胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2.5PEI-U/mg，抗-CMV效价不小于100PEI-U/ml，纯度大于98.2％，蛋白含量为51～55mg/ml。

一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)FI+II+III、FII+III沉淀制备

取经酶联免疫法测定的抗-CMV高效价的人血浆，2～30℃下融浆，合并混合；

①FI+II+III沉淀制备

用生理盐水调节血浆蛋白含量至45～55mg/ml，用冰乙酸调节pH至6.0～6.5，加入95％乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20～25％，反应温度为-5.5～-4.5℃，搅拌反应为4～6小时，反应完毕离心或压滤分离获得FI+II+III沉淀；

②FII+III沉淀制备

用生理盐水调节血浆蛋白含量至45～55mg/ml，用冰乙酸调节pH至6.8～7.2，加入体积比分数为95％的乙醇或无水乙醇并调节乙醇浓度至7.5～8.5％，反应温度为-2.5～-2.0℃，搅拌反应4小时，反应完毕经离心或压滤分离去除FI沉淀，获得上清液，用冰乙酸调节上清液pH至6.0～6.5，加入95％乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20～25％，反应温度为-5.5～-4.5℃，搅拌反应为4～6小时，反应完毕经离心或压滤分离获得FII+III沉淀；

(2)FI+II+III或FII+III沉淀溶解

FI+II+III或FII+III沉淀用0.9～1.1倍血浆量的pH为4.8～5.2、浓度为20～80mM乙酸钠缓冲液在2～8℃下搅拌8～16小时，使沉淀充分溶解，经离心或压滤分离上清液；

(3)辛酸沉淀

用4mol/L乙酸或0.5～1mol/L氢氧化钠调节上清液pH至4.5～5.5，按10～100mmol/L浓度加入辛酸，在18～25℃下搅拌反应1～3小时，经离心或过滤分离上清液；

(4)辛酸病毒灭活

上清液用孔径为1.0μm滤膜过滤，控制过滤压力不大于0.25MPa，用4mol/L乙酸或0.5～1mol/L氢氧化钠调节滤液pH至4.5～5.5，补加注射用水或辛酸调节悬液辛酸浓度至20～80mmol/L，在20～30℃下搅拌1～2小时，离心或过滤分离上清液；

(5)乙醇沉淀