[发明专利]一种猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒II型核酸疫苗，其特征在于：在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了猪圆环病毒II型LY株ORF2和猪IL-18基因，所述核酸疫苗共表达猪圆环病毒II型LY株Cap和猪IL-18蛋白。

2.如权利要求1所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于它的步骤如下：

(1)设计并合成了针对猪IL-18的引物pIL18fs/pIL18rs

上游引物pIL18fs为5’-TAAGTCGACATGGCTGCTGAACCGGA-3’，

下游引物pIL18rs为5’CGTGCGGCCGCTTAGTTCTTGTTTTG-3’，

上、下游引物分别加入Sal I和Not I酶切位点，扩增长度为599bp；

设计并合成了针对猪ORF2的引物ORF2fs/ORF2rs

上游引物ORF2fs为5’-CTTACTCGAGATGACGTATCCAAGGAG-3’，

下游引物ORF2rs为5’-CGGGACGCGTATTCATTAAGGGTTAAG-3’，

上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，该对引物扩增长度为727bp；

(2)利用引物pIL18fs/pIL18rs，PCR扩增猪IL-18基因，将PCR产物经Sal I和Not I双酶切回收后，插入pIRES的MCS B位点上，得到真核表达质粒pIRES-PIL18；

(3)利用引物ORF2fs/ORF2rs，PCR扩增ORF2基因，PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段，插入同样处理的重组真核表达质粒pIRES-PIL18的MCS A位点上，得到真核表达质粒pIRES-ORF2/PIL18，制成猪圆环病毒II型核酸疫苗。

3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增猪IL-18基因的步骤为：以pGEM-T-PIL18质粒为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为：Premix Ex Taq DNA聚合酶25μL，1μL模板质粒，上、下游引物各1μL，补超纯水至50μL，混匀后于PCR仪上进行扩增另设无DNA对照，扩增程序为94℃预变性5min；然后进入94℃40s，58℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后置4℃保存，反应结束后取5μL PCR产物，以1％琼脂搪凝胶电泳观察结果。

4.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR扩增ORF2基因的步骤为：以pGEM-T-PCV2为模板，扩增PCV2 ORF2全基因，反应体系为25μL Premix Ex Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，上、下游引物各1μL，补灭菌去离子水至50μL，PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，58℃50s，72℃3.5min循环，进行30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物的回收。

5.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型核酸疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR产物经Xho I与Mlu I双酶切后，回收目的片段的步骤为：取回收的PCR产物50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、Mlu I 5μL、XhoⅠ5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化3h，电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带，电泳观察回收情况。