[发明专利]检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒

说明书

技术领域

本发明涉及检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)及柯萨奇病毒A16(coxsackievirus A16，CA16)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，它们是在儿童中引发手足口病(hand and foot and mouth disease，HFMD)主要的两种病原。我国在20世纪80～90年代流行的HFMD病原体以CA16为主，但是自2008年以来，中国内地很多地区出现手足病的局部暴发，基本上是EV71和CA16的共循环所致(曲梅，李洁，贾蕾，檀晓娟，高志勇，严寒秋，郭婧，李锡太，黎新宇，王全意，许文波，黄芳；北京市2009年手足口病的病原构成及柯萨奇A组16型病毒基因特征分析；病毒学报；第26卷第6期；432-436页)。手足口病的免疫保护以特异性中和抗体为主，血清中和抗体水平是判断人群及个体对EV71敏感性的重要指标；手足口病中和抗体的检测也是疾病确诊的重要依据。另一方面，因为手足口病主要危害低龄儿童，病死率又高，针对EV71和CA16的疫苗的研制十分紧迫。而疫苗能否在体内诱导出高滴度的中和抗体是疫苗评估和质量控制的重要依据。因此开发出适合于快速，大规模地检测EV71和CA16病毒的中和抗体滴度的方法十分重要。

目前比较常用的检测中和抗体效价的方法有三大类：病毒中和试验，酶标记检测方法，抗原-抗体间接凝集抑制试验。(English reference：Stanley，Plotkin，Walter Orenstein，Paul Offit；Vaccines，Fifth edition；poliovirus vaccine(inactivated，IPV)Page 618-19；查锦芬，肖长义，佐满珍；疫苗中和抗体体外检测方法的研究进展；中国医药生物技术2008年10月第3卷第5期；374-377页)。

病毒的中和试验是一种以比较病毒受血清中和后残存的感染力为依据，进而判定免疫血清中和病毒能力的方法。早期的病毒中和试验用动物接种，检测病毒感染后血清中残留病毒的感染力，现在已全部被细胞水平的中和试验代替。此类方法均以判定残留的病毒感染力作为标准，主要包括以下几种方法：1.细胞病变中和试验。通过观察中和抗体中和病毒后的细胞病变程度来判定血清中和抗体的水平。但是观察到细胞病变需要时间较长，且受观察者主观因素的影响较大，并且很难根据细胞病变的程度对于中和抗体的活性给出一个定量的评估。2.斑点减少中和试验。正常细胞代谢时会摄入活性染料，但是在病毒感染导致细胞死亡时，细胞会丧失该能力，从而形成无色的噬斑。所以，如果病毒被中和的话，病毒感染导致的噬斑就会减少。与细胞病变一样，产生噬斑的时间也较长，因而根据其数量的变化从而判断残存的感染力同样也需要较长时间，而且受观察者主观因素的影响较大。3.快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)。将一定量的病毒与系列稀释的待测血清在体外中和后，加入敏感细胞孵育，最后用荧光标记的针对病毒衣壳蛋白的抗体染色，以检测未被抗体中和的残余病毒量(荧光灶)，最后与病毒对照组相比较，可以算出各种待测血清降低病毒的荧光灶50％的稀释度。最后与已知中和抗体滴度的参照血清比较，最终算出每种待测血清的中和抗体滴度(Sirkka Vene，Mats Haglund，Ake Lundkvist，Lars Lindquist，Marianne Forsgren；Study of the serological response after vaccination against tick-borne encephalitis in Sweden；Vaccine 25(2007)366-372)。病毒中和试验是WHO规定的目前检测中和抗体的参考方法，但该试验不仅耗时，而且由于试验中多使用活病毒，所以还需要相应的生物安全设备。试验对技术人员操作的要求高，成本也较昂贵，不适合大规模的筛选试验。此外，活病毒的传代易造成病原漂变，不利于试验的均一性。