[发明专利]重组羧肽酶B的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种羧肽酶B的制备方法，具体地说，涉及一种在酵母中制备重组羧肽酶B的方法。

背景技术

羧肽酶B(carboxy peptidase B，简称CPB，EC3.4.17.2)是一种含锌的胰外肽酶，其能特异性水解肽链C末端的碱性氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。羧肽酶B含307个氨基酸残基，分子量为35KDa。

CPB目前广泛用于蛋白质及肽类C末端氨基酸测序，或用于蛋白质或多肽的C末端碱性氨基酸残基的修饰。在医学上还用于诊断胰腺炎。在基因工程领域，CPB也获得了越来越广泛的应用，特别在重组人胰岛素的生产过程中，CPB为不可或缺的双酶之一，其比活性的高低及稳定性是影响胰岛素原活化收率的一个重要参数。

目前制备活性CPB的方法主要有两类：一类是从动物的胰腺中提取并活化以获得CPB，但是该方法目前并不能完全去除其他蛋白酶，并且还可能使所制备的CPB中含有感染物质，如病毒、朊病毒、或其他具有损害人体健康潜能的生物活性组分，因此应用有限；另一类是在大肠杆菌中通过基因重组的方法制备CPB，该方法先经表达得到不具活性的CPB酶原，然后使CPB酶原包涵体经过复杂的变性、复性过程，再经过酶切切去酶原的前肽部分，才能得到有活性的酶，而在所述变性、复性过程中，复性率不可能达到100％，因此该方法费时费力，产率不高，一般每升发酵液的产量都不高于10mg。

在中国专利200410098027.5中，公开了一种在酵母真核表达系统中重组表达CPB酶原，然后经过纯化、酶切、浓缩、再纯化等步骤来制备CPB的方法。由于CPB酶原的前肽部分在CPB的N端，该方法通过在CPB酶原的N末端添加组氨酸标签(His tag)，形成“组氨酸标签-前肽-CPB”，然后在亲和层析过程中进行酶切，从而实现CPB与前肽分离，避免了前肽以非共价的方式结合于CPB上。但是该方法工艺步骤非常复杂：一方面是该方法在重组表达后要先进行纯化，再进行酶切，酶切后还要进行二次纯化；另一方面是应用该方法进行酶切时，CPB随穿透液(Flow Through)流出，收集到的液体体积非常大，需浓缩后才能进行后续的二次纯化。

因此，现在亟需一种新的制备活性CPB的方法，既能够高水平地重组表达CPB，又能够很简单方便地进行后续处理工艺(纯化，浓缩，超滤等)。

发明内容

本发明的目的是解决现有上述问题，提供一种制备羧肽酶B(CPB)的方法，该方法表达量很高，并且表达产物CPB酶原无需经过变性和复性，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的CPB，并且后续的纯化步骤也简单方便。

因此，为了实现本发明的目的，本发明提供一种羧肽酶B(CPB)的制备方法，该方法包括：

1.提供一段核苷酸序列，所述核苷酸序列由编码CPB酶原的基因序列和编码组氨酸标签(His tag)的密码子组成，并且所述编码组氨酸标签的密码子在所述编码CPB酶原的基因序列的3’末端；

2.将上述核苷酸序列克隆到酵母表达载体中；

3.将上述载体转化至酵母宿主；

4.诱导上述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签的CPB酶原；

5.酶切上述CPB酶原，生成C端带有组氨酸标签的CPB；

6.纯化上述CPB。

优选地，步骤1中的所述编码CPB酶原的基因序列可以根据所用酵母宿主的密码子偏好性来确定，以增加宿主的表达效率。该方法为本领域技术人员所公知的技术，具体的确定基因序列的方法可参见例如《内蒙古大学学报》，“大场合酵母密码子使用对比”，2006，Vol37，No1：34-39。

在基因序列末端添加编码组氨酸标签的密码子，也是本领域技术人员所公知的用于蛋白质纯化的技术，优选地，所述组氨酸标签是一种含有6个连续的组氨酸的氨基酸序列。

步骤2中的所述酵母表达载体可以为任意一种能够和酵母染色体发生同源重组的载体，优选地，所述酵母表达载体为invitrogen公司《毕赤酵母操作手册》中所采用的载体，例如pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pPICZaA、pPICZaB、pPICZaC等。

步骤3中的所述酵母宿主作为一种真核表达系统，能够直接表达构象正确的目的蛋白，无需后续的变性和复性过程(参见例如《生物技术通报》，“甲醇酵母系统”，2000，1：38-41)。因此本发明的方法对酵母宿主的种类没有任何限制，优选的酵母菌株可为汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母、光滑球拟酵母等，更优选的酵母菌株为毕赤酵母。