[发明专利]一种汉族人肾肉瘤样癌细胞系及其制备方法

权利要求书

1.汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，其保藏号为CCTCC C201130。

2.根据权利要求1所述的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的制备方法，包括以下步骤：

将切除的汉族肾肉瘤样癌患者的肾原位肿瘤组织块放入盛有少量无血清含1000单位/ml青霉素和3μg/ml两性霉素B的DMEM培养基的细胞培养平皿中，剔除坏死组织、脂肪结缔组织和血管，将肿瘤组织块于4℃下浸泡于无血清的DMEM培养基中；30分钟后，将肿瘤组织块用剪成1-3mm³的小块，将肿瘤组织块随同浸泡液转移至离心管中，反复摇晃清洗2-3分钟，1500转/分，离心10分钟；弃上清，重新加入DMEM培养基悬浮组织块，反复摇晃清洗2-3分钟，1500转/分，离心10分钟，弃上清；用1ml的DMEM完全培养基重悬组织块，并接种到玻璃细胞培养瓶中；将培养瓶置于37℃，5％CO₂，95％湿度的CO₂培养箱中培养24小时；组织块贴壁后补充加入DMEM完全培养基2-2.5ml继续培养；DMEM完全培养基的配方为DMEM培养基，10％胎牛血清，青霉素100单位/ml，和链霉素100μg/ml。

3.根据权利要求2所述的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的制备方法，具体步骤如下：

A、原代培养：

无菌条件下，取行肾癌根治术患者的肾原位肿瘤组织，放入盛有少量无血清含1000单位/ml青霉素和3μg/ml两性霉素B的DMEM培养基的细胞培养平皿中，剔除坏死组织、脂肪结缔组织、血管等，随后将可肉眼分辨的肿瘤组织块于4℃下浸泡于无血清的DMEM培养基中；30分钟后，将组织块用眼科剪剪成1-3mm³的小块，将组织块随同浸泡液转移至离心管中，反复摇晃清洗2-3分钟，1500转/分，离心10分钟；弃上清，重新加入DMEM培养基悬浮组织块，反复摇晃清洗2-3分钟，1500转/分，离心10分钟，弃上清；用1ml的DMEM完全培养基重悬组织块，并接种到玻璃细胞培养瓶中；将培养瓶置于37℃，5％CO₂，95％湿度的CO₂培养箱中培养24小时；24小时组织块贴壁后补充加入DMEM完全培养基2-2.5ml继续培养；DMEM完全培养基的配方为DMEM培养基，10％胎牛血清，青霉素100单位/ml，和链霉素100μg/ml；

B、传代：

当细胞从组织块中爬出，并有85％以上融合的时候，进行细胞传代；在超净工作台内，于无菌条件下，吸除培养瓶内培养液；用少量D-hanks液清洗培养瓶2次后，加入0.25％胰酶1ml，置37℃，5％CO₂，95％湿度的CO₂培养箱中4-5分钟；待镜下观察大部分细胞的细胞质回缩、细胞间隙增大时，加入DMEM完全培养基4ml中和，反复吹打贴壁的细胞，形成单细胞悬液；D-Hanks液的配方为NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na₂HPO₄ 12H₂O 0.08g，KH₂PO₄ 0.06g，NaHCO₃ 0.35g，1％酚红2ml，超纯水溶解并定容至1000ml，121℃30min灭菌，4℃保存。