[发明专利]人STAT3基因SiRNA慢病毒载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及人信号转导与转录激活因子(Signal Transducton and Activators of Transcription STATs)家族成员，更具体的说，本发明涉及人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法。

背景技术

信号转导和转录活化因子STATs家族是一种存在于细胞胞浆并在激活后能够转入细胞核内与DNA结合的蛋白家族，具有信号转导和转录调控的双重功能。已发现的STATs家族成员有STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6七种，分别由不同的基因编码，广泛参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种生理功能的调控，并与炎症、肿瘤和免疫反应关系密切。

在这些STATs蛋白当中，STAT3与肿瘤的关系最为密切，相当多的证据表明STAT3在细胞恶变的过程中起关键性作用。正常情况下，STAT3的激活对细胞的增殖和分化起着重要的调控作用，但STAT3的异常活化常伴随有细胞的生长失调/增殖失控。在多种人类恶性肿瘤，如白血病、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、甲状腺癌中都发现有STAT3的持续性过度激活。研究证明，STAT3是细胞内EGFR、IL6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号传导通路汇聚中枢，STAT3过度激活可诱导上述与细胞增殖、分化及凋亡密切相关的基因的异常高表达，通过多种途径促进细胞的恶性增殖和转化、抑制细胞凋亡，表现出致癌作用。目前，许多STAT3下游的靶基因已经确定，包括编码抗凋亡蛋白的Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-2基因，细胞增殖相关蛋白编码基因Cyclin D1和Myc，以及促血管发生因子VEGF等，此外，活化的STAT3还可启动cdc2、cyclinB1、mras和e2f-1等靶基因的异常表达，这些效应蛋白一方面通过促进细胞周期进展、抑制细胞的分化；另一方面通过抑制细胞凋亡，延长细胞生存周期，促使细胞恶性转化。现在倾向于认为STAT3是一个癌基因。

由于肿瘤发生是一个多阶段过程，STAT3基因的组成性激活不会单独导致细胞恶变，STAT3持续性激活所发生的细胞变性也不是细胞的终末表型，使用STAT3蛋白的抑制剂或者反义寡聚核苷酸抑制STAT3活性或表达后，可以逆转细胞的恶性型，达到抗肿瘤的效应。为治疗肿瘤开辟新的途径。以STAT3为作用靶点，旨在抑制STAT3活性的抗肿瘤治疗研究目前已取得初步成果。

RNA干扰(RNA interference SiRNA)是由双链RNA介导，在mRNA转录后水平沉默特定基因表达的基因阻断技术，具有四大明显优势：高特异性、高抑制率、放大效应和可遗传性。SiRNA抑制基因表达的效率极高，甚至可以完全阻断基因表达，达到体内基因敲除的目的。目前已成为研究基因功能、细胞内信号传导通路的不可缺少的工具及进行基因治疗的新策略。

慢病毒(Lentivirus，LV)是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构和特征，作为外源基因的载体，已广泛用于体外细胞的转染和基因治疗研究。作为SiRNA载体应用，可以高效感染细胞进行体内基因沉默的研究，避免质粒的低效率转染所带来的种种不便，且转染效果更加稳定。慢病毒载体构建的shRNA表达载体，一方面可以代替瞬时表达载体使用，另一方面，可用于感染其他载体难以转染的细胞，如原代细胞、悬浮细胞等，并可整合到宿主细胞基因组长时间稳定表达，产生稳定的基因沉默效应，在基因治疗中具有良好的应用前景。

发明内容

STAT3与肿瘤的关系最为密切，相当多的证据表明STAT3在细胞恶变的过程中起关键性作用。本发明的目的是利用RNA干扰技术和慢病毒载体技术，构建人STAT3基因的SiRNA慢病毒载体，提供一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体及其构建方法，从而提供一种在体内敲除STAT3基因表达的有效方式，为治疗肿瘤开辟了新的途径。

本发明涉及一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，该载体包括：一段核苷酸序列和慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST，所述核苷酸序列含有针对人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登录号为NM_139276；所述干扰靶序列SiRNA选自：

SEQ ID NO：1：5’-GGCGTCCAGTTCACTACTAAA-3’，或

SEQ ID NO：2：5’AGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3’，或