[发明专利]一种微生物酶法转化白藜芦醇苷为白藜芦醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物酶法转化虎杖提取物为白藜芦醇的工艺方法，属于天然活性物质提取及转化的技术领域。

技术领域

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背景技术

白藜芦醇(resveratrol，Res)。学名为3,4,5-三羟基二苯乙烯，是蒽醌萜类化合物，物理性质为无味、白色晶体粉末；难溶于水，易溶于乙醇，丙酮等有机溶剂。白藜芦醇主要存在于虎杖、葡萄、花生、松树等植物。白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和具有冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的防治作用,白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一。目前国际上白藜芦醇已被广泛应用，导致了白藜芦醇需求的大幅增加。由于化学合成白藜芦醇的工艺还不成熟，其所需白藜芦醇仍源于天然植物。当今国内学者优选的白藜芦醇的提取方法多是用有机溶剂或水从虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc., P.cuspidatum)中提取白藜芦醇苷(polydatin, PD)，又叫虎杖甙，虎杖甙物理性质为白色针状结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，微溶于水。再用酸、碱或酶法解去甙上的糖，转化为甙元而成。虎杖甙的含量随产地不同差异较大，一般含量在1～4%。

经文献和专利查新，已有文献和专利报道从虎杖甙制备白藜芦醇苷的方法。如中国专利申请号201010022075.1采用专用固定化酶对虎杖材料粗提液进行生物转化，短时间内使其中白藜芦醇类似物转化为白藜芦醇，然后采用萃取分离技术获得高纯度的白藜芦醇。本发明可提高虎杖材料中白藜芦醇含量10-20倍，避免了同类技术中转化时间过长、催化时间不易控制以及反应完成后酶无法回收造成成本提高的问题，同时采用层析、结晶等分离、精制技术，获得大于95％的白藜芦醇和一定纯度的副产物大黄素两种产品。田天丽的论文（四川大学学报，2008）从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株T234 ,利用该菌株产生的β-葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇.转化率达98 %。尽管相关专利申请和研究论文较多，但仍然不能很好解决酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，难以有效应用生产实际。

发明内容    

本发明的目的就针对上述缺陷，从虎杖内生菌中筛选到一株高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株。从根本上解决酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，促进生产实践应用。

发明内容之一. 提供一种能发酵生产虎杖糖苷水解酶并高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株，该菌株经分子生物学和形态学鉴定为棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatus），该菌株2010年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No.3876。

在一个实施方案中，其中说述菌株的筛选过程：从各地采野生虎杖样品，采用虎杖提取物配制不同的培养基，从虎杖内生菌中进行筛选，将刚采集的新鲜虎杖的根状茎在自来水下冲洗干净，沥干水分，切割成2~3 cm小段，按常规无菌操作进行如下表面消毒处理：75%酒精漂洗3~5 s，0.1%升汞漂洗4~5 min，无菌水冲洗4~5次。将上述处理过的根状茎在无菌条件下剥开取其韧皮部，将韧皮部外围剪去，再剪切成0.5 cm×0.5 cm的小片，放置于PDA平板上，每个平板放置4块，30℃培养3~7 d后，即见样品剪切过的边缘有真菌菌丝长出，真菌菌丝经纯化后转接到PDA斜面上培养好后备用。将保存至斜面上的菌种发酵，检测其粗酶液转化PD生成Res的效果，进行复筛。筛选到多个菌株，逐一复筛进行虎杖糖苷水解实验，得虎杖糖苷水解酶高活性菌株，进行菌种签定。

在另一个具体实施方案中，所述菌株棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatus），CGMCC No.3876的形态特征为：菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊；从泡囊的全部表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗；小梗单层或在顶部再分枝成2个至多个的小梗。分生孢子串生于小梗顶端，作辐射状排列或丛集成柱形，着褐色、形状、大小和纹饰的变化很大。