[发明专利]春石斛兰多倍体复合体的人工培育及种苗工厂化生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及兰花人工培育方法及其种苗工厂化生产技术，特别是一种春石斛兰(Dendrobium Nobile)人工多倍体复合体的培育及种苗工厂化生产方法。

背景技术

石斛兰(Dendrobium)，是世界四大观赏洋兰之一。目前国际上已培育出大量石斛兰观赏品种，2010年在东京召开的世界兰花大会上，一株开了2000多朵花的石斛兰获得金奖，石斛兰新品种培育已成为世界花卉育种的新热点。然而，迄今为止，世界石斛兰花新品种的培育多采用品种间杂交获得。例如CN200710160571.1和CN200710160572.6公开了一种春石斛组织培养快繁方法和工厂化栽培方法。这些方法存在品种间杂交变异范围窄，新品种选育频率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种春石斛兰人工多倍体复合体的培育及种苗工厂化生产方法，可以克服一般品种间杂交变异范围窄，新品种选育频率低的缺陷。它是通过“基因组多倍化与杂交相结合”的方法。首先，将普通二倍体春石斛兰人工诱变成同源四倍体春石斛，然后，与二倍体春石兰杂交，创造出三倍体春石斛兰新种质，在此基础上，再将三倍体春石斛兰人工诱变成六倍体春石斛兰。三倍体、六倍体春石斛兰都是迄今为止在自然界不存在的品种，是人工创造的新物种，具有极强的生命力和应用价值。本发明同时还建立了通过春石斛兰种子类原球茎(PLBs)进行春石斛兰多倍体复合体种苗工厂化生产技术，种苗生产可达100万株/年以上，为春石斛兰新品种推广奠定了基础。

本发明提供的一种春石斛兰花人工多倍体复合体的培育及其种苗工厂化生产方法包括以下步骤：

在普通二倍体春石斛兰开花期进行人工授粉，取收获的蒴果，将种子接种在1/2MS液体培养基中进行非共生萌发培养，将原胚期种子原球茎移入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变培养，后转入1/2MS固体培养基光照培养，直至春石斛兰成苗，选取染色体数目2n＝76的四倍体幼苗进行开花培养，开花后，以四倍体为母本，二倍体为父本(4x♀×2x♂)或以二倍体为母本，四倍体为父本(2x♀×4x♂)杂交，获得三倍体春石斛兰。三倍体春石斛兰杂交种子形成早期(原胚期)再移入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行六倍体人工诱变处理，处理150-180h后，转入1/2MS固体培养基光照培养，直至春石斛兰成苗，选取染色体数目2n＝114的幼苗，为加倍成功的六倍体春石斛兰。然后进行瓶苗移栽。按常规的春石斛兰栽培管理，直至开花。

本发明提供的一种春石斛兰花人工多倍体复合体的培育及其种苗工厂化生产方法包括以下步骤：

1、四倍体春石斛兰培育方法步骤如下：

1)二倍体春石斛兰的开花与人工授粉：按常规方法进行春石斛兰的栽培管理，每年春天4-5月份，在春石斛兰开花后一周内，进行自花或同株异花人工授粉，授粉后的春石斛兰要精心管理，放在通风、半透光，室温20-25℃，湿度30-50％条件下，防止落花落果，收获成功授粉后，生长4-5个月后的蒴果。

2)春石斛兰种子非共生萌发培养：取上述授粉后4-5个月得到的蒴果，在超净台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向切开，将春石斛兰种子接种在1/2MS液体培养基中，间歇振荡，进行种子非共生萌发培养20-60天。至种子类原球茎(PLBs)发育成球形。

3)四倍体春石斛兰的人工诱变：将发育成球形的种子原球茎(原胚期)移入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变处理，处理150-180小时后转入1/2MS固体培养基上继续培养，室温25℃，培养30-60天：在光周期14小时/天，光强度3000Lux，直至春石斛兰成苗移栽。

4)四倍体春石斛兰染色体鉴定：在瓶苗移栽时，按株编号，取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理4小时，后将根尖转入体积比为3∶1的甲醇与冰醋酸固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用。用卡宝品红染色液染色，压片法制备染色体标本，400倍以上显微镜观染色体数目，选取染色体数目2n＝76的幼苗，为加倍成功的四倍体春石斛兰，其他染色体数目的幼苗，不能使用。

5)四倍体春石斛兰的栽培管理：四倍体春石斛兰除植株健壮，叶片加厚，花大，抗病性提高外，其他与二倍体春石斛兰基本相同，栽培管理条件也相同。