[发明专利]春石斛兰多倍体复合体的人工培育及种苗工厂化生产方法

权利要求书

1.一种春石斛兰人工多倍体复合体的培育及其种苗工厂化生产方法，其特征在于它包括以下步骤：

在普通二倍体春石斛兰开花期进行人工授粉，取收获的蒴果，将种子接种在1/2MS液体培养基中进行非共生萌发培养，原胚期原球茎移入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行同源四倍体的人工诱变培养，后转入1/2MS固体培养基光照培养，直至春石斛兰成苗，选取染色体数目2n＝76的幼苗，在昼夜温度在25-15℃条件下进行培养，直至开花。然后进行三倍体春石斛兰的杂交转育，以四倍体为母本，二倍体为父本或以二倍体为母本，四倍体为父本杂交，获得三倍体春石斛兰；三倍体春石斛兰杂交种子形成早期(原胚期)再移入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行六倍体的人工诱变培养，诱变处理150-180h，后转入1/2MS固体培养基光照培养，直至春石斛兰成苗；选取染色体数目2n＝114的幼苗，为加倍成功的六倍体春石斛兰，然后将进行瓶苗移栽，按常规的春石斛兰栽培管理条件，直至开花。

2.一种春石斛兰人工多倍体复合体的培育及其种苗工厂化生产方法，其特征在于它包括以下步骤：

四倍体春石斛兰花的培育方法：

1)二倍体春石斛兰按常规方法进行栽培管理，在开花后的5-10天内进行自花或同株异花授粉，授粉后的春石斛兰植株放在通风、半透光、保持30-50％湿度、15-25℃温度条件下，直至蒴果形成；

2)在人工授粉后的春石斛兰生长4-5个月后，剪下蒴果，在超净工作台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞水溶液消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色春石斛兰种子接种在1/2MS液体培养基中，间歇振荡，进行种子非共生萌发培养20-50天，至种子类原球茎(PLBs)发育成球形；

3)四倍体春石斛兰的人工诱变：春石斛兰种子非共生萌发培养约20天后，在种子类原球茎形成初期(原胚期)，移入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行人工四倍体的诱变，诱变处理150-180小时，然后转入1/2MS固体培养基上继续培养，室温25℃，光周期14h/天，光强度3000Lux，培养60-90d，直至春石斛兰成苗移栽；

4)四倍体春石斛兰染色体鉴定：在瓶苗移栽时，按株编号，取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理4小时，后将根尖转入体积比为3∶1的甲醇与冰醋酸固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用。用卡宝品红染色液染色，压片法制备染色体标本，400倍以上显微镜观染色体数目，选取染色体数目2n＝76的幼苗，为加倍成功的四倍体春石斛兰。

三倍体春石斛兰花的培育方法：

5)按通常方法，以四倍体春石斛兰为母本，二倍体春石斛兰为父本或以二倍体春石斛兰为母本，四倍体春石斛兰为父本，进行人工杂交，杂交所产生的种子为三倍体春石斛兰种子，即：4x♀×2x♂或2x♀×4x♂→3x；

六倍体春石斛兰花的培育方法：

6)六倍体春石斛兰是通过三倍体春石斛兰杂交第一代种子的人工诱变获得的，其步骤是：

(1)在四倍体与二倍体春石斛兰杂交授粉后15-20周时，剪下杂交蒴果，按上述步骤2)、3)的方法，在超净工作台内，用75％酒精将朔果消毒1分钟，再用0.1％升汞水溶液消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色石斛兰种子接种在1/2MS液体培养基中，振动或静止，进行种子非共生萌发培养20-60天，至种子类原球茎(PLBs)发育成球形；

(2)将发育成球形的种子原球茎(原胚期)转入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中处理150-180小时，进行六倍体春石斛兰的人工诱变；

(3)将诱变处理后的春石斛兰原球茎转入1/2MS固体培养上，继续培养，直至春石斛兰成苗形成；

(4)通过染色体数目鉴定，确定2n＝114的幼苗为加倍成功的六倍体春石斛兰；

所述的四倍体种苗的工厂化生产方法包括以下步骤：

四倍体春石斛兰开花5-10天内，以自花或同株异花进行人工授粉，授粉后的春石斛兰植株，放在通风、半透光、保持30-50％湿度、15-25℃温度条件下生长；在四倍体春石斛兰人工授粉后150-200天，剪下春石斛兰蒴果，在超净工作台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞水溶液消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色石斛兰种子接种在1/2MS液体培养基中，振动或静止，进行种子非共生萌发培养30-60天，种子原球茎形成，转移至1/2MS固体培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25℃条件下继续培养，培养约60-90天，直至四倍体春石斛兰成苗移栽；按照常规春石斛兰栽培管理；

所述的三倍体春石斛兰种苗工厂化生产方法包括以下步骤：在4x♀×2x♂或2x♀×4x♂人工授粉后150-200天，剪下杂交蒴果，在超净工作台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞水溶液消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色石斛种子接种在1/2MS液体培养基中，振动或静止，进行种子非共生萌发培养；在种子类原球茎形成后，转移到1/2MS固体培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25C条件下继续培养，直至三倍体春石斛兰种苗移栽；按照常规春石斛兰栽培管理；

所述的六倍体春石斛兰种苗的工厂化生产方法包括以下步骤：在4x♀×2x♂或2x♀×4x♂人工授粉后150-200天，剪下杂交蒴果，在超净工作台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞水溶液消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色石斛兰种子接种在1/2MS液体培养基中，振动或静止，进行种子非共生萌发培养；在种子非共生萌发培养约20天后，在种子类原球茎形成初期(原胚期)，移入含有0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变处理150-180小时，然后转入1/2MS固体培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25℃条件下继续培养，直至春石斛兰成苗移栽；

在瓶苗移栽时，按株编号，取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理4小时，后将根尖转入体积比为3∶1的甲醇与冰醋酸固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用。用卡宝品红染色液染色，压片法制备染色体标本，400倍以上显微镜观染色体数目，选取染色体数目2n＝114的幼苗，为加倍成功的六倍体春石斛兰，然后进行瓶苗移栽，按照常规春石斛兰栽培管理。