[发明专利]一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体地，本发明涉及一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长度在22个核苷酸(nt)左右的内源性非编码小分子单链RNA。越来越多的相关研究也同样清楚地显示miRNAs表达与多种人类恶性肿瘤相关，提示miRNAs代表着一种新型癌症生物标记信号。

成熟miRNA片段小，没有poly(A)尾巴，家族成员之间如let-7等通常只有一至少数几个碱基的差别，并且在细胞中的表达水平普遍较低，这些特性给miRNA定量检测方法的建立带来了困难和挑战。尽管如此，科研工作者还是开发出多种检测miRNA的方法，如Northern blotting，微阵列法，以及基于酶扩增的方法如基于PCR反应的检测方法，基于滚环扩增(Rolling Circle Amplification，)的检测方法，基于连接酶反应的方法，恒温指数扩增。Northern blot是验证和确认miRNA的重要方法，但该方法繁琐并且灵敏度较低，不适用于临床样本的高通量检测。芯片技术(microarray)检测方法可以实现快速、高通量的检测。目前已有多种类型的miRNA检测芯片可以选用。但是基因芯片检测方法的重现性和准确性比较差，一般多用于初筛，对获得的结果通常需要采用Northern blot和实时定量PCR进行验证。基于滚环扩增、连接酶反应和恒温指数扩增是近几年兴起的检测方法。也具有较好的灵敏度和特异性。在这些方法中，荧光定量PCR方法无疑是目前检测miRNA表达的最常用方法。常规的荧光定量检测方法中有基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)以及基于polyA加尾的RT-PCR方法。stem-loop RT-PCR的反转引物是由可以自身呈环茎状的特异序列+6到8个miRNA3’端反向互补碱基组成。polyA加尾的RT-PCR的反转引物由特异序列+(T)20左右+兼并碱基V或VN组成。所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的RT引物。这两种方法虽然有较好的灵敏度高和特异性，但仍有不足。对于stem-loop RT-PCR，一条miRNA特异对应一个茎环状结构的反转引物，因此在检测多种miRNA时，需要对该样品进行多次反转。而对于polyA加尾的RT-PCR方法，则需要在反转录前进行末端Poly(A)加尾。由于这两组方法需要多次的反转或加尾，使得这两种方法操作复杂且费用昂贵。因此获得高效，简单，以及经济适用的检测miRNA方法仍然需要分析专业研究者的进一步研究和开发。

碱基堆积杂交(Base Stacking Hybridization，BSH)是指当2条或多条连续的寡核苷酸链与一条长的互补的单链DNA或RNA杂交后，这些短的寡核苷酸链可以获得额外的稳定性。Mirzabekov′s实验室最早提出了碱基堆积杂交技术，他们把微阵列固定于凝胶上，并主要应用于杂交测序。2001年，他们课题组通过检测堆积杂交形成双链后熔解温度的提高，从而来检测堆积杂交的作用。Maldonado-Rodriguez等人把这项技术应用于单碱基突变位点的检测。Rangel-Lopez等人基于堆积作用发展了一种寡核苷酸阵列，用以检测TP53基因的9个突变位点。他们的结果显示用这种方法可以很特异的在多种DNA来源的样品中鉴定出TP53基因常见的突变位点。

鉴于miRNA在生物检测和医学临床上重要的应用价值，本发明利用miRNA的碱基堆积力帮助两条只有少数几个碱基配对的引物互补，在PCR的热循环下，互补的两条引物相互延伸，而无目标miRNA则由于在退火温度下无法稳定结合，因而难以发生扩增反应。整个实验过程，可以通过荧光信号积累实时监测，达到定量检测的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法。

根据本发明的新型荧光实时定量检测miRNA的方法，该方法，利用miRNA、通用引物和特异性引物进行荧光定量PCR扩增，其中

1)设计靶标miRNA的通用引物和特异性引物，其中特异性引物包括直链和茎环引物；

2)以miRNA提供碱基堆积力，帮助特异性引物和通用引物结合，利用DNA聚合酶延伸特异性引物；

3)以上述延伸的DNA链为模板继续延伸通用引物；

4)根据荧光定量PCR结果判断检测样品中是否含有靶标miRNA。

根据本发明的miRNA的荧光定量PCR的方法，可以根据所检测的靶标miRNA设计特异性直链引物或茎环引物，然后结合通用引物进行荧光定量扩增。