[发明专利]建鲤类胰岛素生长因子1启动子SNPs的PCR-RFLP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于建鲤的分子生物学技术领域，涉及建鲤类胰岛素生长因子1启动子SNPs的PCR-RFLP检测技术。

背景技术

类胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)属于胰岛素家族成员，是动物生长轴的重要基因之一，在下丘脑-垂体-性腺信号转导通路中起着重要的作用，其主要生理功能之一是介导生长激素(growth hormone，GH)的促生长作用，促使组织细胞的生长与分化。在次级纤维的形成过程中表达量增加，刺激成肌细胞增殖，维持肌纤维的分化。

单核苷酸多态性(signal nucleotide polymorphisms, SNPs)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，具有分布广泛、数目多且相对稳定等诸多优点，在人类遗传性疾病的病因诊断、治疗和防治方面已受到广泛的重视和强有力的支持。在动物育种方面，SNPs作为一种分子标记辅助育种强有力的工具也得到了广泛的应用，将SNPs与经济性状进行相关性分析，寻找影响性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的候选基因，然后将其运用于后续的育种实践中。作为生长轴上的重要基因，IGF-1基因的SNPs在鸡、猪、牛、羊、鱼等动物上进行了广泛深入的研究，获得了一些与生长、体型等经济性状相关的SNPs。

建鲤是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心采用生物工程育种技术培育出的鲤鱼新品种,具有生长快、体型优、肉质肉味好、饲料转化率高、性温顺、易驯养、适应性与抗病力强、适宜全国各地各种方式饲养的优点。此后，又持续进行了多年的遗传改良和推广工作，并取得了一定的成绩，但在各种经济性状方面还存在较大的选育空间。因此有必要寻找一些与生长相关的SNPs，为下一步建鲤分子标记育种研究工作提供参考。

发明内容

本发明目的之一在于克隆出建鲤IGF-1基因启动子序列，通过测序、序列比对分析找出SNPs；本发明目的之二是基于发现的SNPs，建立IGF-1基因启动子SNPs的PCR-RFLP检测方法，为建鲤生长、体型的标记辅助选择提供有用的分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

建鲤类胰岛素生长因子1启动子SNPs的PCR-RFLP检测方法，其特征在于该检测方法包括利用位于Seq NO.1  第731bp的单核苷酸多态性， PCR扩增出含有多态性位点的基因片段进行检测，其中引物为Seq NO.3和Seq NO.4。

PCR反应条件为：

含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、pH8.0 50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl₂、200umol/L 在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行、反应条件是95℃ 3min、30循环、72℃延长8min，4℃度保存，其中30循环的条件为94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min；5ul PCR产物，加入0.2ul×10U/ul的限制性内切酶，37℃酶切3小时，消化产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

其中所述的多态性是118bp和282bp限制性片段长度多态性如上所述的基因序列。

建鲤IGF-1基因启动子，其核苷酸序列，见Seq NO.1。

一种克隆建鲤IGF-1启动子的方法，按照以下步骤：建鲤血液基因组DNA提取，设计特异引物、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序，获得建鲤IGF-1启动子。其中PCR引物为Seq NO.2和Seq NO.3。

一种建鲤IGF-1启动子SNPs查找的方法，按照以下步骤：10尾建鲤血液基因组DNA提取，设计特异引物、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序，获得10尾建鲤IGF-1启动子，10条序列比对，获得SNPs。

所述的方法还包括建立了建鲤IGF-1启动子SNPs的PCR- RFLP检测方法，所述的限制性内切酶是Hpy188III。 

有益效果

本发明的基因标记和SNP的PCR-RFLP检测技术可用于建鲤IGF-1基因SNPs分析，以及研究基因与建鲤生长、体型相关性能的关系。

 

附图说明：

图1：建鲤IGF-1启动子酶切图，其中AA为A型，TT为T型，AT为杂合型，M为DL1000 marker。

 

具体实施方式