[发明专利]一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中纯化提取冠菌素的方法。

背景技术

冠菌素(Coronatine，简称COR)20世纪70年代末发现的由植物病原菌丁香假单胞菌的几个致病变种产生的一种非寄主专化性毒素(Bender et al.，1999；Palmer et al.，1993)，它是茉莉酸甲酯(MeJA)的环戊烷结构和功能类似物。COR具有多种生理功能，它的活性是JA类物质的100-10000倍左右，在抗胁迫方面尤其显著，可作为一种新型的植物生长调节剂。冠菌素的高效制备具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种从发酵液中提取纯化冠菌素的方法。

本发明所提供的从发酵液中提取纯化冠菌素的方法，包括如下步骤：

1)取发酵液的上清液；

2)将步骤1)得到的上清液用大孔吸附树脂柱进行分离，得到粗提冠菌素；

3)将粗提冠菌素用硅胶柱进行分离，得到纯化的冠菌素；

所述发酵液为发酵菌制备冠菌素时产生的发酵液，所述发酵液为发酵容器内的所有物质。

上述方法中，所述步骤2)中，所述分离方法包括如下步骤：将所述上清液流过大孔吸附树脂柱以进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；其中，所述上清液的速度为10升/小时-15升/小时；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述分离方法包括如下步骤：将所述粗提冠菌素流过硅胶柱以进行吸附，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；其中，所述洗脱缓冲液的流速为0.5ml/min。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液的速度为8升/小时-12升/小时；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述粗提冠菌素的流速为0.5ml/min。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液为如下中的至少一种：乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述洗脱缓冲液为由乙酸乙酯∶甲醇∶水∶乙酸＝10∶2∶0.5∶0.5的体积比组成的混合物。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述洗脱缓冲液的体积用量为所述大孔吸附树脂柱体积的3-6倍；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述粗提冠菌素与硅胶的体积配比为1∶(30-50)。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述大孔吸附树脂为非极性的大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的比表面积为500-920m².g^-1；

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述硅胶的粒径为100-300目或100-200目或200-300目。

上述任一方法中，所述步骤2)中，所述大孔吸附树脂为HPD系列的大孔吸附树脂、YPRII型大孔吸附树脂或HZ系列的大孔吸附树脂；

所述HPD系列的大孔吸附树脂为HPD100型大孔吸附树脂、HPD200型大孔吸附树脂或HPD300型大孔吸附树脂；

所述HZ系列的大孔吸附树脂为HZ802型大孔吸附树脂、HZ803型大孔吸附树脂或HZ818型大孔吸附树脂。

上述任一方法中，所述步骤3)中，洗脱缓冲液的量3倍柱体积，收集第2个柱体积的洗脱液。

上述任一方法中，在所述步骤2)前，包括将所述上清液的pH值调至2.5-5.5的步骤。

上述任一方法中，所述步骤1)中，所述取发酵液的上清液的方法包括如下步骤：将所述发酵液静置放置5-10分钟，以使菌体沉淀，再取上清液。

上述任一方法中，所述步骤3)中，所述硅胶柱的柱高30.5cm；柱外径3.2cm，内径2.6cm。

所述发酵液无需高速离心和加热(可能引起COR降解)去除菌体，只需静置10分钟即可，从而省去高级仪器设备的配置和复杂工艺引起的人力和物力，也避免了COR降解。

硅胶柱层析所用洗脱液可以彻底将COR和发酵液中的杂质分开。

本发明方法采用的大孔吸附树脂对COR的选择性良好、吸附快、解析也快、吸附容量较大、生产周期短；且大孔树脂物理化学稳定性高、机械强度好、再生容易；工艺简单，操作十分简便，溶剂皆可回收利用，成本低廉，适用于大规模工业生产。

本发明省去大量发酵液离心去除菌体的步骤，从而使本提取工艺在没有大量超速离心机的情况下可以实施，同时静置10分钟左右后菌体自动沉积于容器底部，既不影响COR的性质，同时使得尽可能少的菌体量通过柱子，使大孔树脂更充分地吸附COR，同时也使洗脱变得简单，高效。