[发明专利]一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，尤其涉及一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒，该方法是一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术用于检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变。

背景技术

20世纪80年代以来，由于艾滋病和多重耐药结核菌的出现以及流动人口的增加，结核病发病率重新上升，逐渐成为全球危害最严重的传染病。根据世界卫生组织2009年的报告，目前全球有三分之一的人口即20亿人感染结核分枝杆菌，每年新增病人超过900万，其中42万为多药耐药结核，死亡200万。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度居全球第二位，而且耐药情况严重，耐药率高达27.8％，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战。

药敏实验周期过长(需6～8周时间)成为多药耐药结核(MDR-TB)传播的一个主要原因，因此快速诊断对于合理有效地指导临床用药和控制MDR-TB的传播十分必要。由于结核菌耐药的产生主要是基因组DNA中抗结核药物作用靶基因突变所致，因此基因检测更为直接，近年来也得到较快发展。基因检测法的基本过程为先扩增耐药相关基因，然后分析扩增产物。

异烟肼(isoniazid，INH)是1952年开始用于临床的酰肼类化学合成药，是结核病治疗的一线核心药物，同时也是结核分枝杆菌隐性感染的首选药物。但是到目前为止，异烟肼作用的靶分子、作用机制以及结核分枝杆菌耐异烟肼的机制仍不完全明确。较多文献报道它是一种前提药物，在菌体内被katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶激活，作用于细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系而干扰分枝菌酸的生物合成，最终导致菌体细胞壁损伤而死亡。异烟肼耐药相关突变主要发生在KatG315位点，inhA94位点，inhA启动子区和ahpC启动子区(除-46位点)(1.Hazbon，M.H.，et al.，Population genetics study of isoniazid resistance mutations and evolution of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob Agents Chemother，2006.50(8)：2640-2649.2.Luo，T.，et al.，Selection of mutations to detect multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in Shanghai，China.Antimicrob Agents Chemother.54(3)：1075-1081.3.Zhang，M.，et al.，Detection of mutations associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China.J Clin Microbiol，2005.43(11)：5477-5482.)。ahpC启动子区-46G→A为多态性位点，在野生株和突变株均有存在，与耐药突变无关(4、Doustdar，F.，et al.，Molecular analysis of isoniazid resistance in different genotypes of Mycobacterium tuberculosis isolates from Iran.Microb Drug Resist，2008.14(4)：273-279.)。

目前，应用较多的结核耐药突变分析技术包括Sanger测序、线性探针反向杂交法和固相芯片法等。Sanger测序是突变检测的“金标准”，但是在结核耐药检测上，仅适用于突变热点集中的利福平耐药检测，而对于异烟肼耐药位点分散的情况，需要进行多个测序反应，费时费力而且花费昂贵(5.Hazbon，M.H.，Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis.Biomedica，2004.24 Supp 1：149-162.)。