[发明专利]蛋白标签的联合应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新型的蛋白标签及其应用。

背景技术

淀粉结合域(Starch binding domain，SBD)

淀粉是植物的主要能源的储存形式，同时也是人类食物最重要的能源来源。从化学结构看，淀粉可以分为直链淀粉和支链淀粉两大类。直链淀粉是由几百个D-葡萄糖基以a-(1，4)糖苷键连接的葡聚糖，分子量较小，在50000左右；支链淀粉则由几千个葡萄糖以α-(1，4)糖苷键连接为主链，并有α-(1，6)糖苷键连接作为分支点而形成的葡聚糖，分子量比直链淀粉大得多，在60000左右[1]。在天然淀粉中直链的占20％～26％，它是可溶性的，其余的则为支链淀粉。自然界存在很多催化淀粉降解的淀粉酶，在这些酶中大多具有淀粉结合区域(starch binding domain，SBD)，如淀粉葡萄糖苷酶(glucoamylase，GA)、a-淀粉酶、β-淀粉酶、麦芽糖四糖水解酶、麦芽五糖水解酶、环化糊精葡萄糖转移酶等。例如来源于米根霉菌(Rhizopus oryzae)的淀粉葡萄糖苷酶(RoGA)。GA是一种外切葡萄糖水解酶，能够从淀粉的非还原水解释放出β-D-葡萄糖，制糖工业上RoGA广泛用于水解淀粉为葡萄糖浆。RoGA由C-端催化结构域和N-端淀粉结合域(SBD)两部分组成，两个结构域通过O-型糖基化接头连接。碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active enZYmes Database，CAZY，http://www.cazy.org/)按照序列的同源性把RoGA的SBD归类到CBMs(carbohydrate-binding modules)家族21(RoGA CBM21)。

从一级结构来看，RoGA SBD含有106个氨基酸残基，但是从二级结构来看，RoGA SBD与其他SBD家族蛋白一样具有保守的β折叠片段，并且组成类似免疫球蛋白状结构，如图13A，从图中可以明显看到，RoGA SBD有两个配体结合位点(ligand-binding sites)，位点1由Tyr32，Phe58，Tyr67氨基酸残基组成，位点2则包含Trp47，Tyr83，Tyr94氨基酸。正是由这六个带有芳香族侧链的氨基酸和糖环的疏水作用决定了SBD结合底物的亲和力和特异性[Chou，W.I.，et al.The family 21carbohydrate binding module of glucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding.Biochem.J.(2006)396，469-477]。RoGA SBD整个二级结构含有8个反向平行的β折叠片段，分别是β1(V9-Y16)，β2(F21-V27)，β3(V34-D42)，β4(I53-G60)，β5(Y67-A74)，β6(I79-V88)，β7(T92-N95)和β8(Y102-V104)，如图13B。

目前有很多纯化蛋白标签如polyhistidine(Poly-His)，maltose-binding protein(MBP)glutathione S-transferase(GST)，但是由于亲和介质造价昂贵，这些标签难以在工业化水平大规模使用。而淀粉分布广，来源丰富，化学性质稳定，无毒，容易回收，具有被广泛应用的前景，作为一种很好亲和分离的载体[L.J.Chen，C.Ford，Z.Nikolov.A dsorption to starch of a beta-galactosidase Fusion protein containing the starch-binding regionof Aspergillus glucoamylase，Gene99(1991)121-126]。

融合蛋白标签(fusion tag)技术