[发明专利]BK通道阻断剂基因、其重组载体及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型BK通道阻断剂martentoxin基因、其重组载体及其克隆方法。

背景技术

 大电导钙激活钾通道（简称BK通道）是广泛分布于兴奋性和非兴奋性细胞中的一种受电压和钙离子双重门控的钾离子通道，具有调节神经细胞兴奋性、平滑肌的舒张；控制神经递质的释放、激素的分泌；参与非特异性免疫等功能。功能性的BK通道至少由四个α亚基构成，每个α亚基均有10个疏水性α-螺旋结构；辅助性β亚基通常呈组织特异性表达，每个β亚基均由胞外环连接两个跨膜α-螺旋疏水性片段(Lippiat,Standen et al.2003)。α与β亚基共表达，可显著改变BK通道的动力学和药理学特点。

值得指出的是，特异性分布于神经系统中的BK通道亚型（由α和β4亚基共表达构成）被认为具有重要的生理与药理功能效应。这种通道亚型基因欠缺可导致一系列临床疾病。神经系统的BK通道具有较慢的生理动力学特征，且该BK通道亚型对包括经典的iberiotoxin和charybdotoxin等经典的BK通道阻断剂均呈现出相当的非敏感性。因此，为了精确探明该BK通道亚型的生理与药理功能特性，以利设计研发相关临床BK通道疾病的针对性药物，开发BK通道的特异性阻断剂、解析其分子机制、鉴定BK通道上新的药物专一性、药物作用方式、药物作用新靶点、BK通道-阻断剂相互作用新模式，不仅可深度拓展有关BK通道立体结构与功能的知识，为相关BK通道病的诊断与治疗提供细胞与分子学依据, 还可对相应的特异性药物设计提供有益的参考思路Kraft,Krause et al,2003。

野生型的martentoxin 是由东亚钳蝎粗毒中纯化出来的一个37肽阻断剂，分子量为4060 Da，其全长cDNA 开放阅读框长为177 bp，编码59个氨基酸残基的前体（内含22个氨基酸残基的信号肽和37个氨基酸残基的成熟肽），已被鉴定可特异性地作用于大鼠嗜铬细胞的钙激活K⁺ 通道(Ji,Wang et al,2003)。以charybdotoxin为对照，100 nM martentoxin可以阻遏70%的BK电流，相当于charybdotoxin的77%活性。但在NG-108细胞和大鼠背根神经节细胞上，martentoxin对于Kv的作用微乎其微。Biosensor结合实验表明，martentoxin与大鼠脑突触体膜的结合能力比远远高于charybdotoxin，但对于BK亚型，两者药理效应对应互补，400 nM martentoxin可高选择性阻断BK通道（α+β4）电流，这提示martentoxin有可能和一种charybdotoxin非敏感的K⁺ 通道高度亲和。所以martentoxin可以作为研究K⁺ 通道分型、电信号和化学信号的一个重要阻断剂Shi,He et al.2008 。对其进行基因工程表达，便于对其结构和功能进行研究，同时可以进行突变操作，研究特定钾通道的结构和功能。利用原核表达系统，探索简单易行的体外表达程序，使martentoxin得以在体外表达，从而为解决天然阻断剂的稀有性，以及下一步的阻断剂结构与功能的研究提供必要的前提条件。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种BK通道阻断剂基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的重组载体。

本发明的目的之三在于提供该BK通道阻断剂基因的克隆方法

本发明的目的之三在于提供BK通道阻断剂基因重组载体的克隆方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种BK通道阻断剂基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO：1 所示的碱基序列。

一种上述的BK通道阻断剂基因的重组载体基因，其特征在于该重组载体基因为SEQ ID NO：2 所示的碱基序列。

一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求2所述的重组载体。

一种克隆上述的BK通道阻断剂基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：使用5’- ATTGAAGCTTACGCGTCGACTATA（dT）-3’引物逆转录野生东亚钳蝎总RNA，获得BK通道阻断剂基因。

一种克隆上述的重组载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：