[发明专利]猪流感二价灭活疫苗的制备方法及其产品

说明书

技术领域

本发明涉及猪流感疫苗的制备方法，特别涉及猪流感二价灭活疫苗的制备方法以及由该方法制备得到的二价灭活疫苗，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪流感(SI)是由A型流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，是猪呼吸疾病综合征(PRDC)的常见成员。由猪流感病毒(SIV)引起的呼吸道疾病的特征是：突发并在猪群中迅速传播、咳嗽、鼻液、呼吸困难、发热、衰竭、迅速康复或死亡，动物剖检可见肺脏牛肉样实变，病理组织观察可见病毒性肺炎，肺组织内大量炎性细胞侵润。猪流感会导致患病猪容易继发和并发其他病毒病和细菌病，如蓝耳病，传染性胸膜肺炎，猪链球菌病等并发或继发感染，使病情复杂化，严重化，导致猪死亡率急剧上升，从而造成严重的经济损失，已成为严重危害许多国家猪群的疾病。猪呼吸道内存在着能结合猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的受体，3种流感病毒在猪体内重组产生出新病毒的可能性很大，猪体充当着流感病毒的“混合器”，是流感流行的潜在因素。因此，研制猪流感疫苗具有重要的公共卫生学意义。

目前已发现的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2 7种不同血清亚型，广泛流行于猪群中的主要有古典型猪H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2毒株。刘金华等对我国广东、福建、辽宁、北京、河南等省市猪群持续开展了的猪流感病毒及血清学监测，结果，猪流感H1N1亚型病毒的分离率达0.51％，H3N2亚型分离率为0.31％。

猪流感疫苗的效果主要取决于猪群中流行的病毒与疫苗中病毒株的抗原性的“匹配”程度，一般选用本地分离的优势毒株制备疫苗可有效预防当地的猪流感的发生。另外，采用鸡胚培养流感病毒是目前制备人和禽流感灭活疫苗经典的方法。

发明内容

本发明目的之一是提供一种能够对由H1N1或H3N2亚型流感病毒引起的猪流感起到很好预防作用的猪流感二价灭活疫苗；

本发明目的之二是提供一种制备猪流感二价灭活疫苗的方法；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种预防H1N1或H3N2亚型流感病毒引起的猪流感的二价灭活疫苗，包括：猪流感病毒H1N1亚型抗原、猪流感病毒H3N2亚型抗原和免疫佐剂。

本发明猪流感二价灭活疫苗的毒种为H1N1亚型病毒和H3N2亚型病毒，其中，所述猪流感H1N1亚型病毒优选是猪流感H1N1 LN株，其微生物保藏号是：CGMCC No.4141；所述H3N2亚型病毒优选是猪流感H3N2 HLJ株，其微生物保藏号是：CGMCC No.4142。

均具有很好的特异性和免疫原性，能够很好的预防当前猪群中主要流行的H1N1或H3N2亚型病毒引起的猪流感。

一种制备上述猪流感二价灭活疫苗的方法，包括：(1)将细胞系进行传代和培养，细胞长满90-100％；(2)将猪流感H1N1亚型、猪流感H3N2亚型鸡胚毒分别接种长满90-100％细胞的介质上，用细胞维持液培养，制备生产种毒；(3)将所制备的生产种毒分别接种长满90-100％细胞的介质，用细胞维持液培养，得到猪流感H1N1亚型病毒抗原液和猪流感H3N2亚型病毒抗原液；(4)将猪流感H1N1亚型病毒抗原液和猪流感H3N2病毒抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，混合均匀，加入免疫佐剂，乳化，即得。

其中，步骤(1)、(2)或(3)中所述的传代细胞系如下列，但并不仅限于下列细胞：MDCK细胞系、MDBK细胞系、vero细胞系、BHK-21细胞系、CEF细胞系、PBS-1细胞系、Marc-145细胞系、PER-C6细胞系、MEK细胞系或FRhk-4细胞系。

步骤(1)中所述细胞系的传代和培养包括：将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90-100％时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞培养方法优选为以下任意一种：在转瓶中培养，使其细胞密度达到2×10⁵-6×10⁵/ml；在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养，使细胞密度达到2×10⁶-5×10⁶/ml，所述的附着载体优选为微载体或纸片；

步骤(1)、(2)或(3)中所述的培养温度优选是33-37℃，所述的细胞培养环境是5％CO₂；所述的病毒培养时间优选为30-72小时；

步骤(2)或(3)中所述的接种量为0.15-2％细胞毒种或MOI为0.002-0.005细胞毒种。