[发明专利]以纯棉毛巾为载体的固定化脂肪酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及固定化脂肪酶技术领域，特别涉及以纯棉毛巾为载体的固定化脂肪酶的制备方法。

背景技术

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），也叫三酰基甘油酰基水解酶，它可以催化天然油脂进行水解，生成脂肪酸、甘油、甘油单酯或二酯，是生物体内脂代谢不可缺少的重要水解酶。脂肪酶是一种生物催化剂，其最突出的特点就是能够在油水界面催化反应，与化学催化剂相比，具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、污染低等优点。然而，在实际使用过程中，游离酶即使在最适反应条件下也存在易失活、催化反应不稳定、与产物分离困难或分离成本高等缺点。另外，脂肪酶酶制剂或者是通过微生物发酵产生，或者是从动物、植物体内提取的，分离纯化成本高，导致酶的生产价格较高，加上游离酶很难重复利用，导致酶制剂的使用成本提高，从而限制了游离酶在工业生产中大规模的应用。

酶的固定化是指将酶束缚或限制于一定区域内，但仍保留其催化特性并可回收和重复使用的一类技术。固定化脂肪酶与游离脂肪酶相比最大的优势在于：固定化脂肪酶可以重复使用、连续操作、能够控制产品组成、简化和更加高效地催化反应。这就要求在固定化过程中不仅要使脂肪酶保持最大活性，还要满足工业反应器中催化反应的要求。因此，高效固定化脂肪酶依赖于很多因素，除了高活性的脂肪酶之外，还包括固定化酶载体、反应溶剂以及反应器类型。其中，酶的载体通常被认为是生物催化剂固定化反应器性能的最重要部分。固定化酶所用的载体有改性硅胶、大孔树脂、活性炭、硅藻土、凹凸棒土、层状硅酸盐、丝瓜络、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯丙烯胺、卡拉胶、气凝胶、海藻酸钠、磁性淀粉微球、蚕丝、蛋壳以及复合二氧化硅等。

国内外研究者主要通过脂肪酶固定化载体的选择、处理，固定剂的选择及固定化方法方面进行研究，并且取得了一定的研究成果。例如，谭天伟等采用吸附法将脂肪酶固定在经共固定剂处理的惰性载体膜或纺织物上，固定化载体可与金属丝网复合，形成新型反应器。其不足之处在于采用吸附法实现脂肪酶的固定化，酶与载体之间的结合力不强，易脱落[中国专利申请公开文献CN145667A ，公开日为2003.11.19]。刘新喜等在棉纤维膜上用高碘酸钠法固定化脂肪酶，其特点是用一定浓度的高碘酸钠溶液在室温下处理棉纤维膜一段时间，用蒸馏水清洗至中性，再和缓冲液配制好的酶液交联24h得固定化酶。其特点是该方法达到了脂肪酶被重复使用的目的，稳定性较好。固定化原理为高碘酸钠先将棉纤维膜上存在着的邻二羟基的碳键氧化成醛基，继而与酶蛋白上的氨基进行醛胺缩合反应形成希夫碱，通过共价交联得到固定化脂肪酶。其不足之处在于此法反应剧烈，交联时间长，反应过程中容易导致酶失活（刘新喜，彭立凤.棉纤维膜上高碘酸钠法固定化脂肪酶[J].河北师范大学学报（自然科学版）2001,25（1）：80-83.）。张宝华等以丝瓜络作为脂肪酶固定化的载体，所得到的固定化脂肪酶活力回收率高、重复使用率高、并且固定化好的酶能够多次使用而不失活。其特点在于载体丝瓜络需要用氢氧化钠溶液在70~95℃的情况下洗涤12h，以去除多余的油脂，经清洗后超声3h，经上述工序处理过的丝瓜络载体干燥后与有机溶剂按一定比例混合后加入脂肪酶粉在摇床中固定16±2h，用有机溶剂冲洗三次，室温干燥得固定化脂肪酶。其不足之处在于载体处理需要70~95℃的高温下处理12h，能耗高；需超声处理，需有机溶剂（环己烷、正庚烷、正己烷）清洗，提高了固定化酶的生产成本；固定化周期过长[中国专利申请，公开号为CN101260396A ，公开日2008.09.10]。Givanildo等通过过滤的方式将阳极氧化铝与聚乙烯亚胺相结合，之后通过戊二醛的交联作用促使聚乙烯亚胺-阳极氧化铝形成网状结构，用缓冲溶液冲洗10次得到聚乙烯亚胺-阳极氧化铝复合载体，然后与胰蛋白酶相结合，得到固定化胰蛋白酶。载体通过聚乙烯亚胺处理的固定化胰蛋白酶比载体未经聚乙烯亚胺处理所得到的固定化酶酶活高[Givanildo Bezerra Oliveira et al. Enzyme immobilization on anodic aluminum oxide/polyethyleneimine or polyaniline composites[J].Reactive&Functional Polymers 68(2008)27-32.]。美国俄亥俄州立大学杨尚天教授研究小组开发的创新型固定化酶反应器技术，用纯纤维状基质作为固定化酶的载体，高度分支的阳离子聚合物聚乙烯(polyethyleneimine, PEI)和戊二醛(glutaraldehyde, GA) 处理其表面。PEI先吸附在载体表面，并通过静电吸附酶，GA使PEI-酶聚集体交联并覆盖在支持物表面实现固定化，酶的载量是单层共价键固定方法的几倍，酶活也会保持在90%以上，其热稳定性也至少提高了10-20%，但是在交联反应中醛基与氨基反应生成C=N希夫键易于水解，特别是在较高温度时水解更严重，在固定化过程中酶活性损失较大；在贮存中由于自动聚合而形成很多不同物质，性质不稳定；另外戊二醛也是一种有毒物质，对操作者身体不利 （美国专利号US7166451，申请日为2004.02.24）。