[发明专利]以纯棉毛巾为载体的固定化脂肪酶的制备方法

权利要求书

1.以纯棉毛巾为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：首先将聚乙烯亚胺水溶液滴在毛巾上，待毛巾吸收聚乙烯亚胺水溶液完成后，加入用蒸馏水配好的脂肪酶溶液，经恒温摇床震荡，酶吸附在含有聚乙烯亚胺的纯棉毛巾上，除去上清液，再用交联剂对吸附了酶和聚乙烯亚胺的毛巾进行交联，交联完成后，取出毛巾，用缓冲液清洗毛巾，直到没有蛋白洗脱下来，室温下干燥得到固定化脂肪酶；所述脂肪酶包括碱性脂肪酶、猪胰脂肪酶或酯化用脂肪酶，所述交联剂包括三羟甲基磷水溶液或戊二醛水溶液和三羟甲基磷水溶液的混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于脂肪酶水溶液的配制方法为：称取8.0g的脂肪酶粉剂，加入50ml蒸馏水磁力搅拌，充分溶解，酶溶液呈浑浊的浅褐色悬液且没有结块，将酶溶液装入离心管中，然后在漩涡混合器上混合10min，12000rpm、10°C下离心20min；倒出上清液，在沉淀中再次加入40ml蒸馏水进行溶解、离心，重复两次，上清液混合在一起，测其蛋白含量，放入冰箱中4°C保存，并且尽快使用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪胰脂肪酶水溶液浓度为5.0mg/ml，碱性脂肪酶水溶液浓度为0.5mg/ml，酯化用脂肪酶水溶液浓度为0.25mg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为1.5~6.0 mg/ml、pH为4.0~10.0；所述三羟甲基磷水溶液的浓度为0.05%~0.50%（v/v）；所述交联剂戊二醛和三羟甲基磷的混合物由浓度为0.26%（v/v）的戊二醛水溶液与浓度为0.10%（v/v）的三羟甲基磷水溶液按照体积比1:3~3:1混合得到；所述交联时间为5~200min；所述吸附温度和交联温度均为0℃~40℃；所述缓冲液为醋酸盐缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述醋酸盐缓冲溶液用来清洗吸附了猪胰脂肪酶或酯化用脂肪酶且经交联剂交联后的毛巾，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液用来清洗吸附了碱性脂肪且经交联剂交联后的毛巾。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于聚乙烯亚胺水溶液的浓度为1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml或6.0mg/ml，pH为4、5、6、7、8、9或10；交联剂三羟甲基磷水溶液的浓度为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%或0.50%（v/v）；交联剂戊二醛和三羟甲基磷的混合物由浓度为0.26%（v/v）的戊二醛水溶液与浓度为0.10%（v/v）的三羟甲基磷水溶液按照体积比1:3、1:1或3:1混合得到；交联时间为5、10、20、30、60、120、150、200min；吸附温度和交联温度均为0、4、15、30或40℃；醋酸盐缓冲液的浓度为0.1M，pH为4、4.5、5、6或7，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的浓度为0.1M，pH为8.0、8.6、9.0、9.6或10。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺水溶液的加入量为0.1~0.9ml，交联剂加入量为2ml，缓冲液的使用量为75ml/g毛巾，猪胰脂肪酶水溶液的加入量为1~400mg/g毛巾、碱性脂肪酶的加入量为1~30mg/g毛巾、酯化用脂肪酶加入量为1~7mg/g毛巾。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为3.37mg/ml、pH为7.0；三羟甲基磷水溶液浓度为0.10%（v/v）；交联剂戊二醛和三羟甲基磷的混合物由浓度为0.26%的戊二醛水溶液与浓度为0.10%的三羟甲基磷水溶液按照体积比1:1混合得到；吸附温度为40℃，交联温度为15℃；交联时间为20min；醋酸盐缓冲溶液的浓度为0.1M、pH为5.0，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的浓度为0.1M、pH为9.0。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺水溶液的加入量为0.5ml，猪胰脂肪酶水溶液的加入量为250mg/g毛巾、碱性脂肪酶的加入量为27mg/g毛巾、酯化用脂肪酶加入量为6.25mg/g毛巾。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：交联剂三羟甲基磷水溶液是由四羟甲基氯化磷与氢氧化钾按摩尔比1：0.995混合反应制得；具体制备方法为：取四羟甲基氯化磷溶于去离子水中，相应质量的氢氧化钾溶于去离子水中，在磁力搅拌器搅拌下，氢氧化钾水溶液缓缓的加入到四羟甲基氯化磷溶液中，反应结束，制得交联剂三羟甲基磷水溶液。