[发明专利]黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物检测领域，具体涉及一种黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是一种能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素(AFT)目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1为毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。当哺乳动物摄入AFB1污染的饲料后，在体内经羟基化会将AFM1分泌于乳汁当中。奶牛经摄入黄曲霉毒素B1污染的饲料后产出的牛奶中便含有黄曲霉毒素M1。由于黄曲霉毒素M1相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素M1不仅要检测动物饲料原料，而且要检测最终产品。为此世界各国都规定了牛乳及其制品中黄曲霉毒素M1的最大允许含量并将其作为强制性标准，如中国政府规定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油)中黄曲霉毒素M1的最高允许含量为0.5 ng/mL。

现有技术中常用的黄曲霉毒素检测技术主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫学分析法。前两者具有样品前处理步骤繁琐，耗时费力，仪器价格昂贵，需要专业人员操作等的缺点，而免疫学分析法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、对实验人员和环境的污染危害小等优点。最常用的免疫学分析法有酶联免疫吸附法、纳米金免疫层析法等。目前已有黄曲霉毒素M1 的ELISA试剂盒问世，如德国拜发R-Biopharm公司以及美国Abraxis公司等研发的黄曲霉毒素M1 ELISA检测试剂盒。而基于纳米金的免疫层析快速检测技术因其更短的检测时间和更简单的样品前处理而显示出更大的应用价值和应用前景。但目前世界上还没有针对黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条问世。因此，研究建立一种针对黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条对于监控黄曲霉毒素M1的含量具有很重要的意义和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条用于检测黄曲霉毒素M1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：

黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条（见图1和图2），包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA)，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。

所述的杂交瘤细胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201018。其具有序列表中SEQ Gene No.1所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ Gene No.2所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ Protein No.1所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ Protein No.2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素M1，对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC₅₀ 为67 pg/mL。

本发明采用的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法，步骤如下：

（1）采用两步筛选法获得杂交瘤细胞株2C9：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素M1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株2C9；

（2）将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体。