[发明专利]一种制备奶牛性别控制精子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及性别控制精子的制备方法，具体地说，涉及一种奶牛性别控制精子的制备方法。

背景技术

性别控制(sex control)技术，即X/Y精子分离技术，是利用X、Y精子中DNA含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机预测精子类别，给液滴附加电荷，根据静电原理，将X、Y精子分离开来(例如，Johnson LA，Pinkel D.Modificationof a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis ofmammalian spermatozoa.Cytometry 1986，7：268～273)。该技术在畜牧生产中意义重大，该技术可以按照生产需求人为地控制动物后代的性别，快速繁育高产家畜，加速家畜育种进程，提高畜牧业的经济效益，促进畜牧业发展。

在哺乳动物中，每一个体的X精子和Y精子，其DNA含量都是恒定的。根据研究，所有哺乳动物X染色体的DNA含量都要高于Y染色体，相差大多在3.6％-4.2％之间。而这种差异就是X和Y精子流式细胞仪分离的理论基础。其中奶牛X、Y精子差异为3.8％，猪为3.6％，绵羊为4.2％等多种哺乳动物X、Y精子DNA含量差异都已近获得。

不同动物精子对温度的敏感性、精子膜上化学成分(如蛋白质和磷脂的比例以及胆固醇和磷脂的比例和羟链的不饱和程度)等可能不同，而奶牛精子的抗冻能力比其他精子的抗冻能力强，奶牛冷冻精子的人工授精的受胎率已达到85％以上。

奶牛精清中的抗氧化物质会对原精有保护作用，但精子经过稀释处理后，这种保护作用就会降低。此外，在奶牛性别控制精液的生产过程中会有大量的自由氧产生，且用流式细胞仪分离精子会导致奶牛精子的受精能力降低，尤其是再经过低温存储或者在液氮中冷冻保存之后，精子的受精能力会明显下降。同时经过分离的精子的存活时间会明显比原精液存活时间短。这是由于精子质膜富含不饱和脂肪酸，且对自由氧超级敏感(Sikka 1996)，因此脂质氧化在精子功能上具有关键的作用，而分离及冷冻操作会造成脂质过氧化，从而造成精子的损伤尤其是对精子顶体膜的损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备奶牛性别控制精子的方法。

为了实现上述目的，本发明的制备奶牛性别控制精液的方法，其在奶牛精子分离之前的缓冲液中加入2-O-葡糖糖苷抗坏血酸，然后用流式细胞分离仪分离奶牛精子，将分离得到的奶牛性别控制精子回收到含有2-O-葡糖糖苷抗坏血酸的冷冻液中。

本发明的上述制备方法中，所述AA-2G在缓冲液中的终浓度为150-250μM，优选为200μM；所述2-O-葡糖糖苷抗坏血酸在所述冷冻液中的浓度为150-250μM，优选为200μM。

本发明中所述性别控制精液是将精子进行性别分离制得的单一性别精液。其是通过X/Y精子分离技术，利用X、Y精子中DNA含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机预测精子类别，然后给液滴附加电荷，根据静电原理，将X、Y精子分离开来，从而对精子进行性别分离，制得单一性别精液。

2-O-葡萄糖苷抗坏血酸(AA-2G)是抗坏血酸(VC)的一种衍生物，由于2位上有葡萄糖基掩蔽，所以不易发生氧化，所以在水溶液中特别稳定，并且没有直接还原性。AA-2G在酶的作用下能很快的释放出高活性的VC，能很快与自由基反应以降低脂质过氧化作用。因此，在奶牛精子上分离机之前的缓冲液中和分离后的收集液中添加抗氧化剂AA-2G，能够提高奶牛性控精子的受精能力和存活时间，且该性控冷冻精液进行人工输精后受胎率达到85％以上。

具体地说，本发明的制备奶牛性别控制精液的方法，包括如下步骤：

1)取一定量奶牛原精液，用Hepes缓冲液稀释至200×10⁶精子/mL，然后加入荧光染料烟酸己可碱(H33342)至终浓度为0.11mM及AA-2G至终浓度为150-250μM，在34℃水浴中染色45min；

2)用含有重量体积比4％提纯卵黄和重量体积比5％食品红的Hepes缓冲液进一步稀释至100×10⁶精子/mL；

其中，添加食品红的目的是减弱死精子上的H33342荧光，使这部分精子在分离过程中被弃除，提高分离精子的活力；