[发明专利]检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片及其应用

说明书

  

技术领域

本发明属于致病菌检测技术领域，具体涉及基于gyrB基因沙门氏菌特异序列的用于沙门氏菌检测的聚丙烯酰胺凝胶芯片。

背景技术

沙门氏菌是进出口食品中常见的致病菌，也是导致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌，在我国占食物中毒的第一位。国外由于沙门氏菌造成的中毒事件也屡见不鲜，2008年美国圣保罗沙门氏菌感染疫情爆发，沙门氏菌蔓延至23个州，228人感染，其中造成一人死亡。我国国家质量监督检验检疫总局明确规定沙门氏菌为必检项目。因此准确、快速地检测食物及环境中的沙门氏菌，对于沙门氏菌防治具有十分重要的意义。

现有技术中，通常使用PCR方法检测，但是需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，而且也有一定的非特异性扩增。基因芯片方法由于其具有检测效率高，快速，简便，自动化程度高等优势已经成为分子检测中的主要方法之一，目前聚丙烯酰胺凝胶芯片检测技术已经比较成熟。

本发明的芯片探针基于gyrB基因。gyrB基因即促旋酶（gyrase）的B亚单位基因，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。gyrB基因序列全场约1.2~1.4kb，平均碱基替换率为每100万年变化0.7%~0.8%，比16S rDNA的每5000万年变化1%的速度快。另外，由于其作为蛋白编码蛋白，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第三位碱基，这就使得gyrB基因序列在鉴定细菌近缘种方面，具有较高的分辨率。Lzumi等通过分析9株变形假单胞菌的gyrB基因序列，设计出特异性引物，并对肠道和肾脏样品进行PCR分析，结果表明，此种方法可以快速检测由变形假单胞菌引起的疾病。目前，gyrB基因序列分析在蛭弧菌属、芽孢杆菌属、巴氏肺炎球菌属和苯酚分解菌等相近菌株的快速检测中效果显著。

发明内容

技术问题：

本发明提供了一对基于gyrB基因，能够快速检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片，此芯片能够高效、快速地检测出试样中含有的各种沙门氏菌。

技术方案：

一种检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片，包括固相载体和点载在固相载体上的一条寡聚核苷酸片段，序列为：S-Acryl: 5’-TTTTTTTTCTGCTGGCAGAATAC-3’。

所述及的寡聚核苷酸片段为基于沙门氏菌的gyrB基因专一序列，包括7种沙门氏菌的gyrB基因片段。

所述及的沙门氏菌的gyrB基因片段由扩增gyrB基因通用引物扩增获得，序列为：

TEMgyr-for: AACGCCGATCCACCCGAA

TEMgyr-rev: GAATCGCCTGGTTCTTGC，5’端TAMRA荧光标记。

检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片在检测沙门氏菌第II 亚属Salmonella sub-genus II（CMCC50215）、沙门氏菌第III 亚属Salmonella sub-genus III b（CMCC50381）、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis（CMCC50335）、肠炎沙门氏菌danysz 变种Salmonella enteritidis var. danysz（CMCC50100）、鸡沙门氏菌Salmonella gallinarum（CMCC50770）和曼彻斯特沙门氏菌Salmonella manchester（CMCC50380）中的应用。

有益效果：

与现有技术相比，本发明的芯片具有检测周期短、操作简单、结果可靠、灵敏度及自动化强高等优点，有助于对人和动物常见所有沙门氏菌病的早期临床诊断，并对于公共卫生，畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要意义。

附图说明：

图1 是应用本发明沙门氏菌PCR快速检测芯片的检测准确性结果图。

具体实施方式：

实施例：

现采用该芯片，对7株常见沙门氏菌进行检测，同时以6株粪便中常见的其它致病菌株做为对照，来验证本发明快速检测芯片的准确性及灵敏度。

一、检测样品制备