[发明专利]解磷恶臭假单胞菌L13及其发酵工艺

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株解磷恶臭假单胞菌及其发酵工艺。 

背景技术

土壤中的总磷源只有1％～5％是以可被植物利用的可溶性磷的形式存在的。由于土壤的吸附作用，传统化学肥料在施入土壤之后90％左右很快会被土壤固定而成为植物不可利用的难溶性磷，最后能以稳定形态存在的可溶性磷只有一小部分。所以，在20世纪80年代之后，随着农业的持续发展，土壤中的可溶性磷有了相当大程度的降低，而土壤中的无机总磷源降低的幅度相比之下却很少。 

在作物根际中存在各种有益微生物菌群，我们称之为植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)解磷菌(PSB)就是它们之中最为典型的一员，它们在促进磷元素被植物所吸收的同时，也推动了其在广阔的自然界中的循环作用。解磷恶臭假单胞菌L13(Pseudomonas putida L13)是华中农业大学农业微生物国家重点实验室微生物工程室筛选得到的一株可高效溶解无机和有机可溶性磷的植物根际促生长菌。玉米盆栽试验结果显示这株解磷恶臭假单胞菌具有较好的应用效果：它对玉米的干重、湿重、株高、根长及磷的吸收都具有显著促进作用(p＜0.05)，其中，玉米对土壤全磷的利用率从16.15％提高到23.07％。 

目前国内外虽然关于解磷菌(phosphate solubilizing bacteria，PSB)和植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria)的研究比较多，并取得一定成果，但是其培养方面的相关报道很少，对于解磷恶臭假单胞菌的培养没有固定的培养基。目前国内外应用较多的培养基-牛肉膏蛋白胨培养基来培养猪链球菌。这种培养基虽然使用方便，但在培养过程中，具有菌体生长缓慢，成本高等缺点，发酵终点活菌数为10～20亿，不适合大规模增菌使用。 

解磷恶臭假单胞菌的生长繁殖所需条件较广泛，但生物量普遍不高，其培养基中若含有葡萄糖，则会由于菌体生长过程中pH的剧降导致菌体贴壁生长甚至死亡。现常用的种子培养基牛肉膏蛋白胨培养基是不含葡萄糖营养物质较丰富的培养基，但成本较高，不适合大规模生产。因此，完全有必要研制并开发适合工业规模化生产，且原料来源广泛，价格低廉，能大幅度提高活菌数的培养基。 

在本申请提出以前，华中农业大学2010年10月6日公开了一株高效解磷的丁酸梭菌A5-4及应用(专利公开号：CN101851596A，专利申请号：2010101534192，专利申请日：2010年4月21日)，该解磷丁酸梭菌A5-4为厌氧菌，主要应用于处于厌氧环境中的污水处理及水稻淹水状态下的促生菌，由于该菌只能应用于厌氧环境，其实际应用范围较窄，且发酵生产工艺较为复杂。与上述发明相比，本发明的解磷恶臭假单胞菌可应用于好氧与微好氧环境，发酵工艺操作简单，解磷能力为丁酸梭菌A5-4的两倍以上，且该菌具有更强的环境适应能力，应用领域更广，理论上可适用于绝大多数陆生作物。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一株解磷恶臭假单胞菌L13及其发酵培养基，采用上述培养基培养解磷恶臭假单胞菌，有利于细菌的生长代谢，与其他培养基相比能获得较高的菌量，而且材料来源广泛 且价格低廉，在微生物肥料生产过程中能得到高纯度的细菌。使用本发明提供的液体培养基进行大规模培养，可有效扩增解磷恶臭假单胞菌，获得纯化的细菌以供微生物肥料生产。 

本发明提供的高效解难溶性有机磷和无机磷的解磷菌L13，在农作物的根际土壤中可将难溶性磷源转变为可溶性磷源以供作物吸收从而促进作物的生长。本发明可极大提高磷肥的利用率和改善土壤微生态环境，同时本发明的菌株具有较强的环境适应能力，可在-4～40℃及8％以内的NaCl高渗环境中生存，具有较强的应用前景。 

实现本发明技术方案如下所述： 

申请人从湖北省武汉市郊区的土壤中分离筛选得到一株具有高解磷能力的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)L13，该菌株于2010年12月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2010342。 

申请人建立了一种解磷恶臭假单胞菌L13的发酵方法，其包含如下步骤： 

(1)制备一级种子：取保藏号为CCTCC NO：2010342的恶臭假单胞菌L13斜面种子在LB培养基平板上划线，置28℃培养箱培养14h，出现游离单菌落，得到一级种子；